本发明涉及生物工程领域，具体属于一种人工改造的耐胰蛋白酶的植酸酶基因设计、定点突变改造、重组植酸酶的表达纯化和鉴定，以及其在饲料添加剂中的应用。
背景技术：
植酸(ip6，myoinositolhexakisdihydrogenphosphate)广泛存在谷物、油料和豆类中，对无机离子、蛋白质等都具有螯合作用,是植物性饲料中存在的主要抗营养因子之一，从而影响动物对营养物质的吸收。在植物性饲料含有相当数量的磷，其中50％以上是以植酸磷的形式存在的,而单胃动物因缺乏分解植酸所必需的酶而不能有效地利用植酸磷。植酸酶是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸(盐)的一类酶的总称，属磷酸单酯水解酶。植酸酶具有特殊的空间结构，能够依次分离植酸分子中的磷，将植酸(盐)降解为肌醇和无机磷，同时释放出与植酸(盐)结合的其它营养物质。在猪、禽等单胃动物日粮中添加植酸酶，可降解植酸盐的抗营养作用，提高饲料中磷的利用率，减少畜禽粪便中磷的排出量，减少环境污染。因此，在饲料中添加植酸酶对提高畜禽业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要的经济及生态意义。
大肠杆菌植酸酶appa，属于组氨酸酸性磷酸酶家族，是迄今所知的分解植酸能力最强的植酸酶之一，其ph范围与目前商业生产的曲霉属植酸酶相比，更适于在动物的胃肠道内发挥作用。然而，在猪、禽等单胃动物的消化系统中存在大量的蛋白酶包括胰蛋白酶，对胰蛋白酶的敏感性制约着植酸酶在饲料工业生产中的广泛应用。
技术实现要素：
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种改良的耐胰蛋白酶的植酸酶基因及其编码的植酸酶，改良后的植酸酶对胰蛋白酶有更好的耐受性，改良后的植酸酶可在饲料添加剂中应用。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种人工改造的耐胰蛋白酶的植酸酶基因appa-m6，是通过对野生型基因定点突变获得，其中在+220、+222、+223、+540、+541、+542、+547、+548和+1089位的碱基发生了改变；其核苷酸序列为seqidno.1所示序列。
一种人工改造的耐胰蛋白酶的植酸酶appa-m6，其在+74、+75、+180、+181、+183、+363位的氨基酸发生了突变，这些位点氨基酸由相应+74k、+75k、+180k、+181r、+183k、+363k突变为+74d、+75q、+180n、+181n、+183s、+363n；该植酸酶氨基酸序列为seqidno.2所示序列。
一种人工改造的耐胰蛋白酶的植酸酶的制备方法，步骤包括：
将改良的植酸酶基因构建到真核表达载体ppic9上，并转化到毕赤酵母gs115中，通过筛选并鉴定高效表达植酸酶的菌株，进行植酸酶的表达纯化。
与现有技术相比本发明的有益效果：
对纯化得到的植酸酶进行酶学性质比较，结果显示，本发明对胰蛋白酶的耐受性明显提高，经胰蛋白酶处理后，野生型植酸酶appa已基本失活，appa-m6残余酶活仍可达到30％，胰蛋白酶酶的耐受性提高了8.7倍，该改良后的植酸酶可在饲料添加剂中应用，具有良好的应用前景。
附图说明
附图1：appa-m6突变结果(突变后的碱基用下划线标出)
附图2：真核表达载体ppic9-appa-m6酶切鉴定结果
(泳道m：核酸markertrans2kplusⅱ；泳道1：真核表达载体ppic9-appa-m6用ecori和noti双酶切产物)
附图3：真核表达载体ppic9-appa-m6的转化及阳性表达菌株的筛选
(泳道m：低分子量标准蛋白；泳道1-7：阳性酵母表达菌株1-7号)
附图4：纯化的植酸酶sds-page结果
(泳道m：低分子量标准蛋白；泳道1：纯化后的野生型植酸酶appa；泳道2：纯化后的植酸酶appa-m6
附图5：植酸酶appa与appa-m6对胰蛋白酶耐受性比较
附图6：植酸酶appa与appa-m6酶学性质比较
(a：最适ph；b：最适温度；c：耐热性；d：热稳定性)
具体实施方式
实施例1植酸酶基因appa的获得
根据genbank中报道的appa序列(dq513832)，委托生物技术公司合成植酸酶基因appa，克隆到t-easy载体上，得到重组质粒t-easy-appa。
实施例2胰蛋白酶酶切位点分析及突变
胰蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶家族，能够专一性的识别多肽链中精氨酸或赖氨酸残基，而处于蛋白表面loop环中的精氨酸或赖氨酸残基极易被其识别。本发明选取位于植酸酶loop环上的六个胰蛋白酶酶切位点74k、75k、180k、181r、183k和363k为候选突变位点。通过同源建模和氢键比较分析，将这六个位点分别突变为74d、75q、180n、181n、183s和363n。
利用定点突变技术组合替换胰蛋白酶酶切位点，以期提高植酸酶的胰蛋白酶耐受性。合成定点突变引物，下划线标记为突变位点。
k74d/k75q引物：
fk74d/k75q
5’-tgccgacggattgttgcccgaccagggttgtccacaatctg-3’(seqidno.3)
rk74d/k75q
5’-cagattgtggacaaccctggtcgggcaacaatccgtcggca-3’(seqidno.4)
k180n/r181n/k183s引物：
fk180n/r181n/k183s
5’-cccacaatccaacttgtgccttaacaatgagtcgcaagacgaatcctg-3’(seqidno.5)
rk180n/r181n/k183s
5’-caggattcgtcttgcgactcattgttaaggcacaagttggattgtggg-3’(seqidno.6)
k363n引物：
f363n
5’-agcagatgagagacaacactccac-3’(seqidno.7)
r363n
5’-caaagacagtggagtgttgtctctc-3’(seqidno.8)
利用三对突变引物(seqidno.3-8)，以带有合成植酸酶基因appa的重组质粒t-easy-appa为模板，通过pcr叠加突变，最终获得突变后的重组质粒t-easy-appa-m6。突变后的appa-m6核苷酸序列见seqidno.1，氨基酸序列见seqidno2，突变结果见图1。
实施例3真核表达载体ppic9-appa-m6的构建
将重组质粒t-easy-appa-m6和ppic9分别用ecori和noti进行双酶切，使目的基因appa-m6以正确的阅读框定向插入真核表达载体ppic9的ecori和noti位点之间，得到重组真核表达载体ppic9-appa-m6。ppic9-appa-m6的酶切鉴定见图2，ppic9-appa-m6酶切后的片段分别为8000bp和1233bp，经测序证明构建正确。
实施例4毕赤酵母的转化
重组真核表达载体ppic9-appa-m6经大量抽提和足量bglii线性化后用来转化毕赤酵母gs115。采用氯化锂转化法转化毕赤酵母。具体操作如下：
a感受态细胞准备
在50mlypd中培养毕赤酵母至od600＝0.8-1.0。收集细胞，用25ml灭菌水洗涤，室温4000rpm离心10min后，用1ml100mmlicl重悬酵母细胞于1.5ml离心管中。以最大转速沉淀细胞15s，以400μl100mmlicl中悬浮细胞，并以50μl/管分装备用。
b转化
将酵母感受态细胞以最大转速离心15s去除licl后，按顺序加入240μl50％peg，36μl1mlicl，25μl2mg/ml单链dna，线性化质粒dna，剧烈涡旋至完全混匀。将转化后的酵母在30℃孵育30min后，在42℃水浴热击25min。8000rpm离心后，涂布100μl经灭菌水重悬酵母细胞于md平板，在30℃孵育2-4天。
实施例5阳性表达菌株的筛选
从md板上挑取转化子并注明编号，在2mlbmgy液体培养基中震荡培养，30℃220rpm增殖培养48h。将以上培养液8000rpm离心10分钟，弃上清，换上新鲜的2mlbmmy培养基震荡培养，30℃220rpm诱导48h。通过对步骤2中的上清液进行活性检测和sds-page蛋白胶检测，筛选出阳性高表达菌株作为表达菌株。共筛选出7株阳性表达菌株，见图3。
实施例6植酸酶的表达及纯化
a植酸酶的诱导表达
转接重组酵母接种到500mlbmgy的1l摇瓶中，以220rpm的转速30℃增殖培养48h。将以上培养液8000rpm离心10min，弃掉上清，更换新鲜的500mlbmmy诱导培养基震荡培养，每隔12h补充甲醇保证甲醇的供给。
b重组植酸酶的纯化
将诱导培养基以8000rpm的转速4℃离心15min，以80％硫酸铵沉淀上清，以12000rpm的转速4℃离心15min后，收集沉淀溶于30ml乙酸钠缓冲液(40mm,ph4.5)并透析。透析后的酶液通过阳离子交换层析(spsepharosetmfastflow)和脱盐(hiprep26/10desalting)两步纯化处理，所得植酸酶sds-page检测结果见图4。sds-page结果分析表明：野生型植酸酶appa的相对分子量约为53kda，而appa-m6约为53～55kda。经毕赤酵母表达的植酸酶appa和appa-m6有糖基化修饰，表达的蛋白分子量的差异是由糖基化程度不同所造成的。
实施例7胰蛋白酶耐受性检测
将植酸酶appa和appa-m6分别用不同比例的胰蛋白酶处理，相对于appa,appa-m6的抗胰蛋白酶能力增强(图5)。当trypsin/protein的混合比为1.5时，野生型植酸酶appa已基本失活，appa-m6残余酶活可达到30％，胰蛋白酶酶的耐受性提高了8.7倍，在当trypsin/protein的混合比为2.1时，appa-m6残余酶活可达20％。
实施例8酶学性质测定
将纯化的植酸酶在不同ph及不同温度条件下进行酶促反应以测定其最适ph和最适温度，结果见图6a-6b。将植酸酶在不同温度(40、50、60、70、80、90℃)下处理15min后测定酶活，确定酶的耐热范围，结果见图6c。将植酸酶在75℃的恒温水浴中分别处理5-30min后，在标准条件下测定残余酶活力，比较酶的热稳定性，结果见图6d。酶学性质测定结果显示，appa-m6的最适ph值为4.5，最适反应温度为60℃，与野生型appa无明显区别，耐热性及热稳定性良好。
序列表
<110>山西大学
<120>一种人工改造的耐胰蛋白酶的植酸酶及其制备方法和应用
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