一种酶促变温高通量制备葡萄糖基甜菊糖苷的方法与流程

本发明涉及一种酶促变温高通量制备葡萄糖基甜菊糖苷的方法，属于甜味剂的生物合成技术领域。

背景技术：

甜菊糖苷是甜叶菊提取物中糖苷分子的总称；由具有甜味的亲水性糖基与疏水性的甜菊醇苷元组成，已鉴定出约40种衍生物。其中莱鲍迪苷A(RebaudiosideA，RA)、Rebaudioside D和Rebaudioside M的味质口感较好，而斯替夫苷(Stevioside，St)、莱鲍迪苷C和其它低分子量甜菊糖苷却带有一定的轻微苦味或甘草余味，这种微苦余味降低了它作为天然甜味剂的品质。甜菊醇口感味质极差，具有严重的苦涩余味，这便赋予甜菊糖苷轻微苦味的特性。因此，除了具有苦味的杂质对甜菊糖苷口感味质有影响外，甜菊糖苷自身的分子结构是产生苦涩余味的重要因素。对甜菊糖苷口感进行改善可从苦味产生的原因出发，一方面除去疏水性苦味杂质，提高甜菊糖苷的纯度，尤其是提高味质甜度最好的RA的含量；另一方面是从分子结构上对甜菊糖苷进行改性，利用酶法糖基化等方法引入糖基对其口感味质进行改善。在甜菊糖苷上嫁接其它基团使外围基团远离甜菊醇苷元，就有可能改善其后苦味；比如对甜菊糖苷进行适度的糖苷化。甜菊糖苷的糖基化或称接枝改性包括化学催化、酶催化和全细胞催化。

用于甜菊糖苷接枝改性的酶主要是糖基转移酶，目前尤以环糊精葡萄糖基转移酶(环糊精葡萄糖基转移酶)为代表，也有少量关于葡萄糖苷酶、呋喃果糖苷酶和半乳糖苷酶的报道。

例如，采用来自嗜碱软性芽胞杆菌的环糊精葡萄糖基转移酶，反应10h后，经纯化得到9种产物，结构分析显示在C-13位和C-19位通过α-1,4糖苷键分别连接了1到3个葡萄糖基，而C-13位连接1个或2个葡萄糖基时，味质与St相比都已改善；当C-13位连接3个葡萄糖基时，甜度则下降(Fukunaga,1989)。Lobov等利用商业化的葡萄糖基酶筛选出普鲁兰酶(Pullulanase)和真菌淀粉酶(Biozyme L)，用于甜菊糖苷的转苷反应，分别得到三种产物；但反应所需时间较长且产物收率小于10％(Lobov,1991)。Abelyan用环糊精作为糖基供体，得到九种转糖基产物，其中两种葡萄糖基甜菊糖苷的甜味特性较好，但产率较低，产率之和为11.6％(Abelyan VA,2004)。Kochikyan用六种菌株生产出不同种类的环糊精葡萄糖基转移酶，以液化淀粉作为糖基供体催化甜菊糖苷转苷，得到七种转糖基产物(Kochikyan V T,2006)。Jaitak等首次将微波辅助手段应用于酶法改性甜菊糖苷，以β-环糊精作糖基供体，用来源于Bacillusfirmus的β-环糊精葡萄糖基转移酶在微波功率80W，反应温度50℃，pH7.0的磷酸缓冲液中反应，主要得到两种α-1,4-葡糖基衍生物，66％的4’-O-alpha-D-葡萄糖基斯替夫苷和24％的4”-O-alpha-D-麦芽糖基斯替夫苷，甜菊糖苷的苦涩味明显降低(Jaitak V,2009)。Yamamoto等用环糊精葡萄糖基转移酶催化甜菊糖苷进行α-l，6位的转糖基反应，甜菊糖苷和淀粉在环糊精葡聚糖酶的催化下反应4h，得到单取代和双取代的葡萄糖接枝产物，产率分别为35.7％和42.9％。等研究反应机理后推断造成α-l，6位的转糖基化作用弱于α-1，4位的转糖基化作用的原因是糖基受体上葡萄糖基的连接方式(Yamamoto K,1994)。佟树敏在50℃下以玉米淀粉作为糖基供体，加入β-环糊精葡萄糖基转移酶对甜菊糖苷进行酶法改性，反应48h后产率为35.5％(佟树敏,1998)。

低通量条件下，我们用α-环糊精葡萄糖基转移酶Toruzyme 3.0L和α-中温淀粉酶双酶法催化水解淀粉改性St，得到十四种甜菊糖苷衍生物；产物的后苦涩味明显改善，口感清甜。优化得到反应的最佳条件：斯替夫苷0.01g/mL，淀粉0.01g/mL，温度60℃，淀粉与斯替夫苷的质量比1：1，环糊精葡萄糖基转移酶的酶活100U/g斯替夫苷，反应4h，St转化率达到77.11％。甜度最高的St-Glc1和St-Glc2的产率最高。其后，我们又以环糊精和斯替夫苷为底物，以10U/g斯替夫苷的加酶量，反应5h后斯替夫苷的转化率最高可达到87.8％。而以性价比较高的玉米淀粉水解液为糖基供体时，在最佳工艺条件下斯替夫苷的转化率为59.9％；以50W微波辐射，55℃下β-环糊精与斯替夫苷的质量比为1.5：1，加酶量10U/g斯替夫苷，反应1min时，斯替夫苷的转化率即达50.5％，但高接枝度的产品较多，口感不好。

美国专利US4219571和US7807206利用嗜热脂肪芽孢杆菌产的环糊精葡萄糖基转移酶，得到具有高达10的聚合度的α-1,4葡糖基衍生物。

美国专利US8257948、US8318459和中国专利CN105899670A以淀粉为底物，先采用α-淀粉酶和环糊精葡萄糖基转移酶处理淀粉，再向反应液中二次添加环糊精葡萄糖基转移酶，随后再经过淀粉酶或其他糖酶的处理，得到α-1,4-葡糖基衍生物，生产工艺繁琐，成本增加。其中中国专利CN105899670A将淀粉加入到水中以形成淀粉悬浮液；再将α-淀粉酶和环糊精葡萄糖基转移酶的混合物加入到淀粉悬浮液中并在约75-80℃下孵育约0.5至2小时，生成液化淀粉悬浮液后通过低pH热处理将α-淀粉酶灭活；然后将甜菊醇糖苷加入到液化淀粉悬浮液中，生成反应混合物，再将第二批环糊精葡萄糖基转移酶加入到反应混合物中并在约5-125℃下孵育约1至168小时；随后加入一种或几种糖酶，将反应混合物在约5-125℃下孵育约0.0001-168小时，其中葡糖基甜菊组合物包含具有二十个或更少的α-1，4-葡糖基残基的甜菊醇糖苷衍生物。所得到的产品使用离子交换树脂或膜进行脱色；再将脱色后的反应混合物与大孔吸附树脂接触来除去非甜菊糖苷化合物并随后用醇或含水醇洗脱吸附的甜菊糖苷；将洗脱液通过填充有离子交换树脂的柱或膜来进行脱盐；从洗脱液中除去醇，获得含水洗脱液；将含水洗脱液浓缩并干燥以获得干燥的葡糖基甜菊糖苷。

上述方法中都涉及到的环糊精葡萄糖基转移酶属于糖酶，该酶的一个特性是结构域对多种底物有区分度，因而反应时通量较低，生产效率需要提高。

环糊精葡萄糖基转移酶的另外一个特性是耐热性能较差，已知三维结构的环糊精葡萄糖基转移酶如BC251环糊精葡萄糖基转移酶在温度为60℃时活性半衰期为10min，B.stearothermophilus环糊精葡萄糖基转移酶在75℃时活性半衰期为10min。Thermococcus kodakaraensis KOD122和Thermococcus strain B1001环糊精葡萄糖基转移酶的活性半衰期分别为100℃时20min和110℃时40min。

通过对文献的对比、归纳总结可知，盐桥、pH和有机溶剂都能改变酶的活性和热稳定性，但是目前还没有规律可循，也不具备普适意义——甚至同一种酶在不同反应体系里的有效稳定剂也不同。环糊精葡萄糖基转移酶催化反应时，底物与淀粉结合后，酸催化剂Glu257将质子给位于亚位点+1和－1葡萄糖间的氧，此键断裂后－1葡萄糖形成过渡态，这种氧碳正离子型的过渡态经正电荷移位形成双键结构，构成平面构像；然后经b-糖苷键连接至亲核的Asp229，过渡态形成稳定的中间产物，+1位被供体本身或其他葡萄糖代替，Glu257激活葡萄糖分子进攻中间产物，经过渡态形成α-糖苷键的最终产物。反应机理为双取代反应(Uitdehaag，2002)。因此用环境因素刺激改变酶的耐热酶时要兼顾上述两种氨基酸残基的特性。

环糊精葡萄糖基转移酶的再一个特性是它可以同时催化转苷和水解反应等4种反应，因此需要针对不同底物和催化环境摸索，按需选择反应条件则可充分利用酶的各种功能，用一种酶实现多种反应。

另外，由于酶催化反应多数为外扩散抑制甚至有底物抑制，所以生产强度也就是反应通量常常较低，大多数文献报道的反应物浓度都在以内2％-5％以内，而高通量反应是所有人都追求的工艺。粗甜菊糖苷的溶解度较高，较高的反应通量相对单一糖苷而言容易达到，但是高品质葡萄糖基甜菊糖苷需要用到低溶解度的甜菊糖苷，需要有一定的手段达到。

综上所述，需要改良制备葡萄糖基甜菊糖苷的方法，提高酶的热稳定性和反应通量，高效地获得高转化率、低接枝度的葡萄糖基甜菊糖苷。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对以上现状的不足和缺点，提高环糊精葡萄糖基转移酶的热稳定性和反应通量，以便能在较高反应温度下以较高浓度的底物反应，高效地获得高转化率、低接枝度的葡萄糖基甜菊糖苷。本发明通过先在较高温度下通过形成包合物溶解反应物，再迅速降温降低分子运动幅度，以钙钡离子盐桥为主要稳定剂并联合极性小分子多元醇如甘油或山梨醇调整酶的构象和结合域开放度，加入含有稳定剂的酶后在较低温度下催化转苷，然后在较高温度下继续催化转苷的同时、催化水解高取代反应物，从而实现酶促变温高通量制备葡萄糖基甜菊糖苷。

具体地，用来源于Geobacillus sp.的环糊精葡萄糖基转移酶为催化剂，以甜菊糖苷为糖基受体，糊精或寡糖为糖基供体，分阶段变温利用环糊精葡萄糖基转移酶的转苷和水解活性，从而以水相酶促变温高通量制备葡萄糖基甜菊糖苷。

更具体地，在80-85℃下将甜菊糖苷和糖基供体溶于一定pH环境的水或缓冲液中，甜菊糖苷水溶液的质量浓度为10％-25％，甜菊糖苷：糖基供体按质量比为(1:0.3)-(1:1.1)，溶解完成后迅速冷却到60-65℃后，向其中加入10-100U/g甜菊糖苷的环糊精葡萄糖基转移酶及酶稳定剂，保持温度开始反应0.5-5h，然后升温到70-76℃反应8-24h，最后升温到75-85℃反应8-24h，至原料甜菊糖苷含量的变化低于每小时0.1％时结束反应；产品经直接喷雾干燥或者稍经浓缩并干燥即得葡萄糖基甜菊糖苷粗产品。残余的糊精或其它还原糖等可经大孔吸附树脂吸附后用水洗脱。

其中，甜菊糖苷限来源于各种甜叶菊的提取物及其化学或酶促转化产品。糖基供体为糊精或寡糖，糊精为麦芽糊精、玉米淀粉糊精、木薯糊精、各种环糊精中的一种或两种的混合物；寡糖为麦芽糖、麦芽三糖、棉子糖和蜜二糖一种或多种的混合物。酶稳定剂是钙钡离子盐，例如氯化钙和氯化钡中的一种或两者的混合物，添加量为酶蛋白质量的0.1％-1％。一定pH环境的水或缓冲液指去离子水或pH5-6.5的磷酸-磷酸铵缓冲液(0.01M)；甘油或山梨醇的添加量为酶蛋白质量的0.1％-5％。本发明大大改善了甜菊糖苷的甜味品质，保证了水解酶的高效性和利用率，降低了葡萄糖基甜菊糖苷的生产成本，得到甜味和口感俱佳的葡萄糖基甜菊糖苷。

其中，所述的环糊精葡萄糖基转移酶来源于Geobacillus sp.，例如来源于Geobacillus thermoglucosidasius(ATCC 43742或CGMCC1.10851)，或Geobacillus tepidamans(ATCC BAA-942)，或Geobacillus thermoleovorans(CGMCC1.8647或ATCC 43513)的环糊精葡萄糖基转移酶，其共性是都具有很好的α-淀粉酶活性。按照本发明提供的一种实施方式，其α-淀粉酶酶活为163.7U/mL，β-淀粉酶酶活为42.3U/mL，环糊精葡萄糖基转移酶的α-环化酶活为83.1U/mL,β-环化酶活为57.4U/mL。

[有益效果]

本发明公开的一种酶促变温高通量制备葡萄糖基甜菊糖苷的方法。不需要灭活和脱色工段，工艺简洁，生产高通量，改善了甜菊糖苷的甜味品质，保证了水解酶的高效性和利用率，提高了原料的转化率，保证酶能长时间保持活性，降低了葡萄糖基甜菊糖苷的生产成本，得到甜味和口感俱佳的葡萄糖基甜菊糖苷。

附图说明

图1葡萄糖基莱苞迪苷A的HPLC图。

图2底物浓度对甜菊糖苷转化率和各产物产率的影响；■St◆St-Glc1▲St-Glc2□St-Glc3◇St-Glc4△St-Glc5。

图3甜菊糖苷：糖基供体比例对甜菊糖苷转化率和各产物产率的影响；■St◆St-Glc1▲St-Glc2□St-Glc3◇St-Glc4△St-Glc5。

具体实施方式

分析计算方法：

(1)未反应甜菊糖苷的定量分析依据GB2760-2014或JECFA2016中甜菊糖苷的分析检测方法。

(2)葡萄糖基甜菊糖苷的定性分析：采用液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪定性转苷产物，检测条件如下：ACQUITYUPLC BEH HILIC氨基色谱柱，柱温为30℃，乙腈：水＝80：20(2min)-50：50(30min)(v/v)下梯度洗脱，进样量1μL，进样浓度为5mg/mL，流速为0.3mL/min；质谱条件为碰撞电压为6eV；离子化方式电喷雾电离(ESI)，负离子检测模式，分子量范围：200-2000。

(3)葡萄糖基甜菊糖苷的定量分析依据GB2760-2014卫计委增补文件中葡萄糖基甜菊糖苷的分析检测方法。

(4)α-淀粉酶酶活用国标GB/T 24401-2009中α-淀粉酶制剂的α-淀粉酶酶活测定方法测定。

(5)β-淀粉酶酶活用DNS(3,5-二硝基水杨酸)法测定，参见P.Bernfeld,“Amylase,αandβ,”in Methods in Enzymology,S.P.Colowick and N.O.Kaplan,Eds.,pp.149–158,Academic Press,NewYork,NY,USA,1955。

(6)环糊精葡萄糖基转移酶α-或β-环化酶活的测定：

取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有2mL预先用10mM磷酸缓冲液(pH6.5)配制的1％(wt)可溶性淀粉溶液的试管中。在60℃下反应10min后，加入1mL盐酸(1mol/L)停止反应，迅速冷却溶液至室温。

测定α-环化酶活时，向上述溶液中再加入0.2mL用10mM磷酸缓冲液配制的0.5mM甲基橙溶液，室温下放置15min，测定其505nm处的吸光度A505。

测定β-环化酶活时，向上述溶液中加入3.5mLNaOH水溶液(30mM)，再加0.5mL用5mMNa2CO3溶液配制的0.02％(wt)酚酞溶液，室温下放置15min，测定其550nm处的吸光度A550。

然后分别参照α-环糊精浓度对应A505、β-环糊精浓度对应A550的标准曲线，分别计算出溶液中α-或β-环糊精的含量。一个α-或β-环化酶活单位分别定义为在上述条件下每分钟生成α-或β-环糊精的μmol数。

实施例1环糊精葡萄糖基转移酶(环糊精葡萄糖基转移酶)的制备

采用Geobacillus sp.菌株(Geobacillus thermoglucosidasius，ATCC 43742)作为生产菌株，以8％的接种量接种后进行分批发酵。培养基组成为：葡糖糖0.8％，乳糖0.05％，蛋白胨1.2％，酵母膏2.4％，K2HPO40.3％，KH2PO40.98％，CaCl20.28％。溶氧上升到85％时，开始流加补料液，菌体生长阶段控制温度33-37℃，溶氧维持在25％-30％；当菌体OD600达到25时，添加1％(质量体积分数)甘氨酸；当菌体OD600达到50时，将温度降为23-27℃并连续补加0.2-0.4g·l^-1·h^-1乳糖，同时采用梯度递减的方式补加补料液；发酵培养30小时后，终止发酵，离心除去菌体后，将发酵液浓缩10倍，其α-淀粉酶酶活为163.7U/mL，β-淀粉酶酶活为42.3U/mL，环糊精葡萄糖基转移酶的α-环化酶活为83.1U/mL，β-环化酶活为57.4U/mL。以下使用时，按其环糊精葡萄糖基转移酶的α-环化酶活计量。

实施例2以木薯糊精和莱苞迪苷A为原料制备葡萄糖基甜菊糖苷

在夹套反应器中加入100kg水，加热到85℃后先后投入15kg木薯糊精和15kg莱苞迪苷A(HPLC含量98％)，搅拌溶解。充分溶解后，迅速冷却到65℃，搅拌下向上述夹套反应器中加入5mL 1％的氯化钙和氯化钡(质量比0.2:1)水溶液、4g甘油和250kU实施例1所得的环糊精葡萄糖基转移酶的溶液。65℃下反应3h，然后升温到75℃反应24h，然后升温到80℃反应10h，结束反应。产品经直接喷雾干燥即得水分含量为2.1％的葡萄糖基甜菊糖苷，,该产品不需脱色可以直接使用于不要求总苷含量不小于95％的产品。产品中莱苞迪苷A的含量为2.9％。

对照例1无稳定剂下制备葡萄糖基甜菊糖苷

在夹套反应器中加入100kg水，加热到85℃后先后投入15kg木薯糊精和15kg莱苞迪苷A(HPLC含量98％)，搅拌溶解。充分溶解后，迅速冷却到65℃，搅拌下向上述夹套反应器中加入250kU实施例1所得的环糊精葡萄糖基转移酶的溶液。65℃下反应3h，然后升温到75℃反应24h，然后升温到80℃反应10h，结束反应。产品经直接喷雾干燥或者稍经浓缩并干燥即得水分含量为2.2％的葡萄糖基甜菊糖苷，产品中莱苞迪苷A的含量为5.2％。

对照例2无稳定剂恒温制备葡萄糖基甜菊糖苷

在夹套反应器中加入100kg水，加热到75℃后先后投入15kg木薯糊精和15kg莱苞迪苷A(HPLC含量98％)，搅拌溶解。充分溶解后，搅拌下向上述夹套反应器中加入250kU实施例1所得的环糊精葡萄糖基转移酶的溶液。75℃反应48h，结束反应。产品经直接喷雾干燥即得水分含量为2.2％的葡萄糖基甜菊糖苷，该产品中莱苞迪苷A的含量为6.1％。

对照例3无稳定剂时甜菊糖苷浓度对制备葡萄糖基甜菊糖苷的影响

图2是以斯替夫苷为例展示无稳定剂且恒定温度下，甜菊糖苷浓度对制备葡萄糖基甜菊糖苷的影响。斯替夫苷：β-环糊精＝1.06:1，60℃，加酶量为10U/g糖苷时，在不同浓度下反应5h后，在低浓度范围内底物浓度与反应速度成正相关性，在底物浓度超过最适底物浓度(5％)时，斯替夫苷的转化率和葡萄糖基甜菊糖苷的产率降低，这是因为产生了底物抑制作用。斯替夫苷的转化率和葡萄糖基甜菊糖苷的产率是根据反应物中相应化合物的浓度与理论计算值来计算的。

实施例3以β-环糊精和莱苞迪苷A为原料制备葡萄糖基甜菊糖苷

在夹套反应器中加入100kg水，加热到82℃后先后投入10kgβ-环糊精和25kg莱苞迪苷A(HPLC含量97％)，搅拌溶解。充分溶解后，迅速冷却到60℃，搅拌下向上述夹套反应器中加入含有10mL 1％的氯化钙和氯化钡(质量比0.5:1)水溶液、2g甘油、2g山梨醇和1000kU实施例1所得环糊精葡萄糖基转移酶的溶液。60℃下反应3h，然后升温到74℃反应15h，然后升温到80℃反应8h，结束反应。产品经喷雾干燥得水分含量为2.0％的葡萄糖基甜菊糖苷，该产品不需脱色可以直接使用于不要求总苷含量不小于95％的产品。产品中莱苞迪苷A的含量为2.2％。用大孔树脂柱洗脱至总苷含量约96％，产品中莱苞迪苷A的含量为3.97％。

实施例4以麦芽糊精和母液糖为原料制备葡萄糖基甜菊糖苷

在夹套反应器中加入0.01M的pH5.8的磷酸盐缓冲液100kg，加热到80℃后先后投入10kg麦芽糊精(DE值为16)和20kg母液糖(HPLC含量97％)，搅拌溶解。充分溶解后，迅速冷却到62℃，搅拌下向上述夹套反应器中加入含有20mL 0.8％的氯化钡水溶液、8g甘油和1250kU实施例1所得环糊精葡萄糖基转移酶的溶液。65℃下反应3h，然后升温到75℃反应24h，然后升温到80℃反应18h，结束反应。产品经浓缩并微波干燥即得水分含量为2.8％的葡萄糖基甜菊糖苷，该产品不需脱色可以直接使用于不要求总苷含量不小于95％的产品。产品中未转化甜菊糖苷的含量为2.7％。用大孔树脂柱洗脱至总苷含量约96％，产品中未转化甜菊糖苷的含量为5.4％。

实施例5以玉米淀粉和斯替夫苷为原料制备葡萄糖基甜菊糖苷

在夹套反应器中加入100kg水，加热到80℃后先后投入10kg玉米淀粉和12kg斯替夫苷(HPLC含量95％)，搅拌溶解。充分溶解后，迅速冷却到65℃，搅拌下向上述夹套反应器中加入含有10mL 0.5％的氯化钡水溶液、3g甘油和250kU实施例1所得环糊精葡萄糖基转移酶的溶液。65℃下反应3h，然后升温到72℃反应15h，然后升温到80℃反应8h，结束反应。产品经喷雾干燥得水分含量为2.3％的葡萄糖基甜菊糖苷，该产品不需脱色可以直接使用于不要求总苷含量不小于95％的产品。产品中斯替夫苷的含量为2.7％。

对照例4无稳定剂时甜菊糖苷：糖基供体比例对制备葡萄糖基甜菊糖苷的影响

说明书附图3是以斯替夫苷和β-环糊精为例展示无稳定剂且恒定温度下，糖苷和糖基供体比例对制备葡萄糖基甜菊糖苷的影响：60℃，加酶量为10U/g糖苷，β-环糊精与斯替夫苷的量比为1.06:1时，斯替夫苷的转化率最高。斯替夫苷的转化率是根据反应物中相应化合物的浓度与理论计算值来计算的。

实施例6以麦芽三糖和母液糖为原料制备葡萄糖基甜菊糖苷

在夹套反应器中加入100kg水，加热到80℃后先后投入18kg麦芽三糖和20kg母液糖(HPLC含量97％)，搅拌溶解。充分溶解后，迅速冷却到65℃，搅拌下向上述夹套反应器中加入含有20mL 1％的氯化钙和氯化钡(质量比1:0.5)水溶液、8g山梨醇和1250kU实施例1所得环糊精葡萄糖基转移酶的溶液。65℃下反应5h，然后升温到75℃反应14h，然后升温到80℃反应6h，结束反应。产品经直接喷雾干燥得水分含量为2.1％的葡萄糖基甜菊糖苷，该产品不需脱色可以直接使用于不要求总苷含量不小于95％的产品。产品中未转化甜菊糖苷的含量为3.7％。用大孔树脂柱洗脱至总苷含量约96％，产品中未转化甜菊糖苷的含量为5.6％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。