发明领域
本发明涉及糖皮质激素系列新的抗炎和抗过敏化合物、这样的化合物的制备方法、包含它们的药物组合物、其组合和治疗用途。更具体地，本发明涉及为异噁唑烷衍生物的糖皮质激素。
发明背景
皮质类固醇是有效的抗炎药，其能够减少炎症细胞的数量、活性和运动。
它们常用于治疗广泛的慢性和急性炎性病症，包括哮喘、慢性阻塞性肺疾病(copd)、过敏性鼻炎、类风湿性关节炎、炎性肠病和自身免疫疾病。
皮质类固醇通过糖皮质激素受体(gr)介导其作用。皮质类固醇结合gr诱导其核易位，由此通过dna-结合-依赖性(例如反式激活)和-不依赖性(例如反式表达(transespression))机制影响许多下游途径。
用于治疗肺中慢性炎性病症例如哮喘和copd的皮质类固醇目前通过吸入施用。使用吸入的皮质类固醇(ics)的优点之一在于将药物直接递送至作用部位、限制全身副作用、由此导致更快速的临床响应和更高的治疗比率的可能性。
尽管ics治疗可以提供重要的有益性，尤其是在哮喘中，但是重要的是将ics全身暴露减少至最低限度，ics全身暴露可以导致不需要的副作用的发生和严重性，它们与长期施用相关。此外，目前临床实践中可得到的ics的有限作用期限促成了对疾病的最适度以下的处置。尽管吸入器技术是靶向肺的关键点，但是调整皮质类固醇分子平台上的取代基对于优化药代动力学和药效学特性而言是重要的，以便降低口服生物利用度、将药理学活性限于肺中(前药和柔和药)并且增加全身清除率。此外，在肺中的长效ics活性是高度期望的，因为每日1次施用ics能够降低施用频率，且由此基本上改善了患者的依从性，且结果是处置和控制疾病。总之，对于研发具有改善的药代动力学和药效学特征的ics存在迫切的医学需求。
糖皮质激素异噁唑烷衍生物例如描述在wo2006/005611、gb1578446和“synthesisandtopicalanti-inflammatoryactivityofsomesteroidal[16α,17α-d]isoxazolidines”(j.med.chem.,25,1492-1495,1982).
一些糖皮质激素异噁唑烷衍生物还描述在共同悬而未决的专利申请wo2011/029547、wo2012/123482和wo2012/123493中。
令人意外地，已经发现本发明的化合物显示改善的药代动力学和药效学特征，例如全身暴露、选择性和作用期限。
发明概述
本发明涉及糖皮质激素系列的抗炎和抗过敏化合物、其制备方法、包含它们的组合物、治疗用途和与其它用于治疗呼吸系统疾病的药物活性成分的组合，在所述其它用于治疗呼吸系统疾病的药物活性成分中有β2-激动剂、抗毒蕈碱药、丝裂原激活蛋白激酶类(p38map激酶)抑制剂、核因子κ-b激酶亚单位β(ikk2)抑制剂、人嗜中性细胞弹性蛋白酶(hne)抑制剂、磷酸二酯酶4(pde4)抑制剂、白三烯调节剂、非类固醇抗炎药(nsaids)、镇咳药、粘液调节剂、粘液溶解药、祛痰药/粘液动力学调节剂(mucokineticmodulators)、肽粘液溶解药、抗生素、jak抑制剂、syk抑制剂、pi3kδ或pi3kγ抑制剂、m3-拮抗剂/β2-激动剂(maba)和m3-拮抗剂/pde4-抑制剂(mapi)。
发明详述
特别地，本发明涉及式(i)的化合物及其药学上可接受的盐：
其中
r1选自直链或支链(c1-c16)烷基、直链或支链(c2-c18)烯基、-or6、芳基、芳基(c1-c16)烷基、-sr6、-n(r4)(r5)、(c3-c8)环烷基、(c3-c8)杂环烷基和杂芳基，其中一个或多个氢原子任选地被(c1-c6)烷基替代，且其中r4和r5独立地选自h或直链或支链(c1-c6)烷基，且r6是直链或支链(c1-c16)烷基；
r2是任选地被一个或多个卤原子取代的芳基。
在本说明书中，除非另有提供，否则术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘原子。
术语“(c1-c16)烷基”是指直链或支链烷基，其中碳原子数为1－16。所述基团的实例是甲基、乙基、正-丙基、异丙基、正-丁基、异丁基、仲-丁基、叔-丁基、戊基、己基、庚基、辛基、乙基-丁基、丙基-丁基、甲基-丁基、乙基-甲基-丙基、十六烷基、十一基、十二烷基、十三烷基、十四烷基(quaterdecyl)、十五烷基(quindecyl)、十六烷基等。
表述“(c2-c18)烯基”是指具有一个或多个双键的直链或支链碳链，其中碳原子数为2－18，所述基团的实例包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、十一碳烯基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基等。
表述“(c3-c8)环烷基”是指具有3－8个碳原子的单-或双-脂环族烃基。实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、双环[2.2.1]庚-2-基等。
表述“(c3-c8)杂环烷基”是指(c3-c8)环烷基，其中至少一个环碳原子被杂原子或杂芳族基团(例如n、nh、s或o)替代。实例包括哌嗪基、噻唑烷基、吡咯烷基、哌啶基、吗啉基等。
表述“芳基”是指具有6－20个环原子、优选6－15个环原子的单环或双环或三环环系，且其中至少一个环是芳族的。
适合的芳基单环系统的实例包括苯基等。
适合的芳基双环系统的实例包括萘、亚联苯基等。
适合的芳基三环系统的实例包括芴基等。
表述“芳基(c1-c6)烷基”是指进一步被芳基取代的(c1-c6)烷基。
本文所用的术语“杂芳基”是指具有5－20个环原子、优选5－15个环原子的单环、双环或三环环系，其中至少一个环是芳族的且其中至少一个环原子是杂原子或杂芳族基团(例如n、nh、s或o)。
适合的杂芳基单环系统的实例包括噻吩、吡咯、吡唑、咪唑、异噁唑、噁唑、异噻唑、噻唑、吡啶、咪唑烷、哌啶、哌嗪和呋喃基团，例如四氢呋喃等。
适合的杂芳基双环系统的实例包括嘌呤、蝶啶、苯并三唑、喹啉、异喹啉、吲哚、异吲哚、苯并呋喃、苯并二噁烷、苯并噻吩基团等。
本领域技术人员显而易见，式(i)的化合物至少在4a、4b、5、6a、6b、9a、10a、10b位置上包含不对称中心且由此可以作为许多光学立体异构体及其混合物存在。
因此，本发明还涉及所有这些形式及其混合物。
优选的化合物是式(i)这样的化合物，其中立体碳原子的立体化学报道在如下的式(i’)中，绝对构型以基于组优先级的cahn-ingold-prelog命名法为基础指定。
且其中r1和r2如上述所定义。
在一个优选的实施方案中，对于式(i’)的化合物，不对称中心4a上的绝对构型是(s)，在4b上的是(r)，在5上的是(s)，在6a上的是(s)，在6b上的是(r)，在9a上的是(s)，在10a上的是(s)，在10b上的是(s)，且在12上的是(s)。
式(i)的化合物可以特别地与药学上可接受的酸形成酸加成的盐。
式(i)的化合物的药学上可接受的酸形成酸加成的盐、由此也包括式(i’)的那些包括与无机酸和有机酸形成的盐，所述无机酸例如氢卤酸，例如氢氟酸、盐酸、氢溴酸或氢碘酸；硝酸、硫酸、磷酸；和有机酸，例如脂族一元羧酸，例如甲酸、乙酸、三氟乙酸和丙酸；脂族羟基酸，例如乳酸、柠檬酸、酒石酸或苹果酸；二羧酸，例如马来酸、富马酸、草酸或琥珀酸；芳族羧酸，例如苯甲酸；芳族羟基酸和磺酸。
可以通过已知的成盐方法由式(i)或(i’)的化合物制备这些盐。
应理解，下述对式(i)化合物描述的所有优选的基团或实施方案可以彼此合并并且也可以根据实际情况做必要的修正应用。
式(i)或(i’)的优选组的化合物为这样的化合物，其中r1选自直链或支链(c1-c16)烷基、直链或支链(c2-c18)烯基、-or6、芳基、芳基(c1-c16)烷基、-sr6、-n(r4)(r5)、(c3-c8)环烷基、(c3-c8)杂环烷基和杂芳基，其中一个或多个氢原子任选地被(c1-c6)烷基替代，且其中r4和r5独立地选自h或直链或支链(c1-c6)烷基，且r6是直链或支链(c1-c16)烷基；且r2是任选地被一个或多个卤原子取代的芳基。
在该组中甚至更优选的是式(i)或(i’)的化合物，其中r1选自甲基、异丙基、乙基、十五烷基、丁基、己基、十七碳烯基、甲氧基、甲基硫烷基、异丁基、异戊基、叔丁基、甲基氨基、二甲基氨基、苯基、环丙基、环戊基、甲基丙氧基、苄基、吡啶基、哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基、噻唑烷基和呋喃基；且r2是对-氯苯基。
下文式(i)和(i’)的化合物及其药学上可接受的盐和溶剂合物称作“本发明的化合物”。
本发明优选化合物的实例是：
(接续)
根据本文所述的类似操作和方法，可以得到如下本发明的优选化合物：
(接续)
(接续)
本发明还提供了药物组合物，其包含本发明这样或作为药学上可接受的盐的化合物和一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂。
可以将本发明的化合物作为单独的活性剂或与其它药物活性成分的组合施用，所述其它药物活性成分包括常用于治疗呼吸系统疾病的那些，例如β2-激动剂、抗毒蕈碱药、丝裂原激活蛋白激酶类(p38map激酶)抑制剂、核因子κ-b激酶亚单位β(ikk2)抑制剂、人嗜中性细胞弹性蛋白酶(hne)抑制剂、磷酸二酯酶4(pde4)抑制剂、白三烯调节剂、非类固醇抗炎药(nsaids)、镇咳药、粘液调节剂、粘液溶解药、祛痰药/粘液动力学调节剂、肽粘液溶解药、抗生素、jak抑制剂、syk抑制剂、pi3kδ或pi3kγ抑制剂、m3-拮抗剂/β2-激动剂(maba)和m3-拮抗剂/pde4-抑制剂(mapi)。
本发明还提供了本发明这样或作为药学上可接受的盐的化合物与选自卡莫特罗、gsk-642444、茚达特罗、米维特罗、阿福特罗、酒石酸阿福特罗、福莫特罗、富马酸福莫特罗、沙美特罗、沙美特罗昔萘酸酯、舒喘灵、沙丁胺醇、左旋沙丁胺醇、特布他林、茚达特罗(qab-149)、azd-3199、bi-1744-cl、las-100977、gsk159797、gsk59790、gsk159802、gsk642444、gsk678007、gsk96108、班布特罗、异丙肾上腺素、丙卡特罗、克仑特罗、瑞普特罗、非诺特罗、比托特罗、brodxatelor和asf-1020及其盐的β2-激动剂的组合。
本发明还提供了本发明这样或作为药学上可接受的盐的化合物与选自aclidinium、噻托溴铵、噻托溴铵
本发明还提供了本发明这样或作为药学上可接受的盐的化合物与选自an-2728、an-2898、cbs-3595、阿普斯特(apremilast)、elb-353、kf-66490、k-34、las-37779、ibfb-211913、awd-12-281、西潘茶碱、西洛司特、罗氟司特、bay19-8004和sch-351591、an-6415、indus-82010、tpi-pd3、elb-353、cc-11050、gsk-256066、奥米司特、ox-914、替托司特、mem-1414和rpl-554的pde4抑制剂的组合。
本发明还提供了本发明这样或作为药学上可接受的盐的化合物与选自塞马莫德、他美莫德、吡非尼酮、ph-797804、gsk-725、gsk856553、gsk681323、minokine和洛吡莫德及其盐的p38map激酶抑制剂的组合。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了本发明的化合物与ikk2抑制剂的组合。
本发明还提供了本发明的化合物与选自aat、adc-7828、aeriva、tapi、ae-3763、krp-109、ax-9657、pol-6014、aer-002、agtc-0106、respriva、azd-9668、zemaira、aativ、pgx-100、弹力素、sphd-400、α1-蛋白酶抑制剂c和吸入的α1-蛋白酶抑制剂的hne抑制剂的组合。
本发明还提供了本发明的化合物与选自孟鲁司特、扎鲁司特和普仑司特的白三烯调节剂的组合。
本发明还提供了本发明的化合物与选自布洛芬和酮洛芬的nsaid的组合。
本发明还提供了本发明的化合物与选自可待因和优选吗啡烷(dextramorphan)的镇咳药的组合。
本发明还提供了本发明的化合物与选自n乙酰半胱氨酸和fudostein的粘液溶解药的组合。
本发明还提供了本发明的化合物与选自氨溴索、高渗溶液(例如盐水或甘露糖醇)和表面活性剂的祛痰药/粘液动力学调节剂的组合。
本发明还提供了本发明的化合物与选自重组人脱氧核糖核酸酶i(α链道酶和rhdnase)和螺杀菌素的肽粘液溶解药的组合。
本发明还提供了本发明的化合物与选自阿奇霉素、妥布霉素和氨曲南的抗生素的组合。
本发明还提供了本发明的化合物与选自ins-37217、地夸磷索、西贝那德、cs-003、他奈坦、dnk-333、msi-1956和吉非替尼的黏液调节剂的组合。
本发明还提供了本发明这样或作为药学上可接受的盐的化合物与选自cp-690550和glpg0634的jak抑制剂的组合。
本发明还提供了本发明这样或作为药学上可接受的盐的化合物与选自r406、r343和prt062607的syk抑制剂的组合。
本发明还提供了用作药剂的本发明的化合物。
本发明还涉及本发明的化合物在减少体外和/或体内炎症细胞数量、活性和运动中的用途。
本发明还涉及本发明的化合物，其用于预防和/或治疗其中涉及炎症细胞数量、活性和运动减少的任意疾病。
在另一个方面中，本发明提供了本发明的化合物在预防和/或治疗其中涉及炎症细胞数量、活性和运动减少的任意疾病中的用途。
特别地，可以施用单独或与一种或多种活性成分组合的本发明的化合物以便预防和/或治疗特征在于气道阻塞的呼吸道疾病，例如哮喘和copd。
在另一个方面中，本发明提供了本发明的化合物在制备用于预防和/或治疗其中涉及炎症细胞数量、活性和运动减少的任意疾病的药剂中的用途。
本发明还提供了用于预防和/或治疗其中涉及炎症细胞数量、活性和运动减少的任意疾病的方法，该方法包括对有这种治疗需求的患者施用治疗有效量的本发明的化合物。
本发明还提供了适合于通过吸入、注射、口服或鼻内施用的本发明化合物的药物制剂。
可吸入制剂包括可吸入粉末、包含抛射剂的计量气雾剂或不含抛射剂的可吸入制剂。
本发明还涉及装置，其可以为包含本发明化合物的单剂量或多剂量干粉吸入器、定量定压式气雾器或喷雾器，特别是柔和雾喷雾器(softmistnebulizer)。
本发明还涉及药盒，其包含单独的本发明化合物或它们与一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂的组合或混合物的药物组合物，本发明还涉及装置，其可以为包含本发明化合物的单剂量或多剂量干粉吸入器、定量定压式气雾器或喷雾器。
可以根据各种合成步骤制备本发明的化合物，所述各种合成步骤根据常规方法或如下所述进行。
在一个方面中，本发明提供了本发明化合物及其中间体的制备方法。
综上所述，本领域技术人员显而易见，通过选择具有适合的立体化学结构的原料，可以得到式(i)的任意可能的立体异构体。
用于制备如下方案中所述的式(i’)的化合物的一些方法也可以适用于式(i)的化合物。
本发明化合物的制备方法
可以根据上述方案中所述的不同反应路线、根据取代基r1和r2性质的不同制备本发明的化合物。
一般而言，可以通过一般反应方案中示例的方法或通过其变型、使用易于得到的原料、试剂和常规的合成操作制备本发明的化合物。在这些反应中，还能够利用本领域技术人员众所周知的变化形式。
式(iii)的化合物易于由已知化合物、通过已知方法、以为式(ii)的化合物原料制备(j.med.chem.1982,25,1492-1495)。它们也可以商购。
式(iv)的化合物可以便利地根据文献中报道的标准方法制备。例如，可以通过用碱例如乙酸钾处理式(iii)的化合物制备它们。该反应通常在适合的极性溶剂例如dmf中进行且典型地在80－110℃的温度范围进行0.5－4小时期限。
式(v)的化合物可以通过水解式(iv)的化合物制备。该反应优选通过使化合物(iv)进行酶，例如来自南极假丝酵母(candidaantarctica)的固定化脂酶(sigmaaldrich)(tetrahedron,50,13165-13172,1994)作用进行。
式(vii)的化合物可以使用用于异噁唑烷形成的已知方法、通过硝酮类的环加成、在低聚甲醛的存在下、从式(v)的化合物与式(vi)的化合物反应开始制备(j.med.chem.,25,1492-1495,1982)。该反应便利地在给质子溶剂例如乙醇中在80－100℃的温度下进行。式(vi)的羟基胺是商购的或易于使用公知方法制备，例如通过用还原剂例如硼烷吡啶复合物(j.med.chem.,40,1955-1968,1997)还原肟或通过使o-四氢吡喃基羟基胺与适合的烷基化试剂例如烷基卤反应(chem.pharm.bull.,46,966-972,1998)来制备。
按照合成反应路线(反应路线a-d)中所述，通过使式(vii)的化合物与式(viii)、(ix)、(x)、(xi)、(xii)或(xiii)的化合物反应易于将式(vii)的化合物的羟基转化成酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或硫代碳酸酯。
如果适合，本领域技术人员可以将适合的变化形式引入特别地在实验中描述的条件，以便使合成反应路线适合提供本发明另外的化合物。这样的变化形式可以包括、但不限于应用适合的原料生成不同的化合物，改变反应溶剂和温度，用类似作用的化学物质替代反应剂，在保护/脱保护阶段引入或除去对反应条件和反应剂敏感的官能团，以及引入或除去定向于化学平台进一步官能化的特定合成步骤。
式(vii)的中间体与酰氯(viii)按照反应路线a反应，得到式(i)的化合物，该反应便利地在dcm(二氯甲烷)作为溶剂中在碱例如三乙胺或dipea(n,n-二异丙基-乙胺)或吡啶的存在下在rt进行4－50小时期限。
或者，反应路线b，式(vii)的化合物的羟基转化成氨基甲酸酯易于通过使式(vii)的化合物与式(ix)的化合物按照已知方法进行。该反应便利地在dcm作为溶剂中在碱例如dmap的存在下在rt进行4－50小时期限。
按照反应路线c，式(vii)的中间体与cdi(1,1'-羰基二咪唑)反应，然后添加期望的醇(x)或硫醇(xi)或胺(xii)，得到式(i)的化合物，该反应便利地在thf(四氢呋喃)中在rt进行4－50小时期限。
或者，反应路线d，式(vii)的化合物的羟基转化成式(i)的化合物可以通过使式(xiii)的化合物与hobt(羟基苯并三唑)反应、然后添加式(vii)的化合物、edc(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)和dmap(4-二甲基氨基吡啶)进行。该反应便利地在dmf作为溶剂中在rt进行4－50小时期限。
从上述内容中应清楚地表明任意所述的基团可以照此存在或以任意适当被保护的形式存在。
特别地，存在于中间体和化合物上且可能生成不需要的副反应和副产物的官能团需要适当地被保护，然后进行烷基化、酰化、偶合或磺酰化。同样，随后那些相同保护基的脱保护可以在所述反应完成后进行。
在本发明中，除非另有指示，否则术语"保护基"表示适合于保护与之结合的基团功能的保护基团。典型地，保护基用于保护氨基、羟基或羧基官能团。适合的保护基由此可以包括，例如苄基、苄氧基羰基、叔丁氧基羰基、烷基或苄基酯类等，它们是本领域技术人员众所周知的[就一般参考文献而言，参见20t.w.green；protectivegroupsinorganicsynthesis(wiley,n.y.1981)]。
有利地，例如，可以以包含0.001－1000mg/天、优选0.1－500mg/天的剂量施用本发明的化合物。
当通过吸入途径施用它们时，本发明化合物的剂量有利地包含0.01－20mg/天，优选0.1－10mg/天。
优选地，可以单独或与其它活性成分组合施用本发明的化合物以用于预防和/或治疗任意的阻塞性呼吸系统疾病，例如哮喘、慢性支气管炎和慢性阻塞性肺疾病(copd)。
然而，可以施用本发明的化合物以用于预防和/或治疗其中涉及炎症细胞数量、活性和运动减少的任意疾病。
这样的疾病的实例包括：相关炎症，例如哮喘和其它过敏性疾病、copd、急性鼻炎；可逆性急性移植物排斥和选择的自体免疫疾病的急性转剧、骨髓移植中的移植物抗宿主病；自体免疫疾病，例如类风湿性关节炎和其它关节炎；皮肤病，例如系统性红斑狼疮、系统性皮肌炎、银屑病、炎症性眼病、自身免疫性血液病和多发性硬化急性转剧；肾、肝、心脏和其它器官移植；贝赫切特急性眼综合征、内源性葡萄膜炎、特应性皮炎、炎性肠病和肾病综合征；何杰金氏病和非何杰金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和慢性淋巴细胞白血病(cll)；自身免疫性溶血性贫血和与cll相关的血小板减少症；白血病和恶性淋巴瘤。
优选地，可以施用本发明的化合物以用于预防和/或治疗呼吸系统疾病，例如从轻度到急性严重性哮喘病症和copd。
现在通过下列实施例进一步描述本发明。
在报道的实验方法中，可以施用如下缩写：tea＝三乙胺；dcm＝二氯甲烷；rt＝室温；acoet＝乙酸乙酯；dmf＝n,n-二甲基甲酰胺；dmso＝二甲亚砜；hatu＝o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐；dmap＝4-二甲基氨基吡啶；dipea＝乙基二异丙基胺。
实施例1
异丁酸2-[(4as,4br,5s,6as,6br,9as,10as,10bs,12s)-8-(4-氯-苯基)-4b,12-二氟-5-羟基-4a,6a-二甲基-2-氧代-2,4a,4b,5,6,6a,8,9,9a,10,10a,10b,11,12-十四氢-7-氧杂-8-氮杂-并戊二环烯并[2,1-a]菲-6b-基]-2-氧代-乙酯(化合物1)的制备
在氮气气氛中在5℃下向搅拌的中间体2(600mg,1.124mmol)和dipea(0.391ml,2.247mmol)在干二氯甲烷(30ml)中的溶液中加入异丁酰氯(0.235ml,2.247mmol)，将该反应化合物在5℃搅拌10min并且在rt搅拌16hr。再加入dipea(0.196ml,1.124mmol)和异丁酰氯(0.118ml,1.124mmol)，将该混合物在rt搅拌72h。再加入另一部分dipea(0.196ml,1.124mmol)和异丁酰氯(0.118ml,1.124mmol)，将该反应混合物在rt搅拌1hr并且在50℃搅拌1.5hr。
用dcm(100ml)稀释该反应混合物，用1nhcl、饱和nahco3溶液和盐水洗涤有机层，干燥(na2so4)，浓缩。通过硅胶快速色谱法纯化粗产物，洗脱梯度为dcm/acoet98:2－dcm/acoet92:8，得到481mg纯化合物(71％收率；rf＝0.37，在acoet/dcm10:90中)。
1hnmr(300mhz,dmso-d6)ppm7.31-7.45(m,2h),7.26(dd,1h),6.98-7.10(m,2h),6.29(dd,1h),6.08(s,1h),5.62(d,1h),5.42-5.78(m,1h),5.06(d,1h),4.90(d,1h),4.18-4.32(m,1h),4.17(t,1h),3.44-3.62(m,1h),2.56-2.71(m,2h),2.63(spt,1h),2.04-2.34(m,3h),1.84-1.96(m,1h),1.63-1.83(m,1h),1.52-1.63(m,2h),1.50(s,3h),1.14(d,3h),1.13(d,3h),0.94(s,3h)
lc-ms(esipos):604.10mh+
[α]d25＝+58.3(c0.2；meoh)
如上述对化合物1所述、通过用适合的酰氯酰化中间体2制备表中列出的化合物：
表1
(接续)
(接续)
实施例2
环戊烷甲酸2-[(4as,4br,5s,6as,6br,9as,10as,10bs,12s)-8-(4-氯-苯基)-4b,12-二氟-5-羟基-4a,6a-二甲基-2-氧代-2,4a,4b,5,6,6a,8,9,9a,10,10a,10b,11,12-十四氢-7-氧杂-8-氮杂-并戊二环烯并[2,1-a]菲-6b-基]-2-氧代-乙酯(化合物15)的制备
将环戊烷甲酸(137mg,1.2mmol,1.2eq)溶于dmf(5ml)，加入1-羟基苯并三唑水合物(162mg,1.2mmol,1.2eq)，将该反应混合物搅拌20分钟。依次加入中间体2(534mg,1mmol)、4-(二甲基氨基)吡啶(305mg,2.5mmol,2.5eq)和edc*hcl(230mg,1.2mmol,1.2eq)，将该反应混合物在rt搅拌过夜。通过tlc分析监测转化(hex/etoac7/6)。用hcl0.6n使反应停止，用etoac将产物萃取2次。用nahco3饱和溶液、盐水洗涤采集的有机相，用无水na2so4干燥。用naoh1n(10ml)、吡啶(用于转移水层中的环戊烷甲酸,2ml)和etoac(30ml)纯化处理粗产物。用水将有机层洗涤2次，用硅胶垫过滤。得到化合物15，为固体，在50℃真空干燥2小时(300mg,收率47.6％)。
lc-ms(esipos):630.10mh+
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm7.34(d,j＝8.82hz,2h),7.19-7.28(m,1h),7.04(d,j＝8.82hz,2h),6.18-6.37(m,1h),5.97-6.13(m,1h),5.46-5.75(m,2h),4.78-5.17(m,2h),4.06-4.31(m,2h),3.42-3.55(m,1h),2.78-2.93(m,1h),2.54-2.74(m,2h),2.09(m,3h),1.49(m,15h),0.93(s,3h).
如上述对化合物15所述、以相应的羧酸为原料制备表2中列出的化合物：
表2
实施例3
异丁基甲基碳酸酯2-[(4as,4br,5s,6as,6br,9as,10as,10bs,12s)-8-(4-氯-苯基)-4b,12-二氟-5-羟基-4a,6a-二甲基-2-氧代-2,4a,4b,5,6,6a,8,9,9a,10,10a,10b,11,12-十四氢-7-氧杂-8-氮杂-并戊二环烯并[2,1-a]菲-6b-基]-2-氧代-乙酯(化合物18)的制备
在rt向在thf(3ml)中的中间体2(350mg,0.66mmol)中分部分加入cdi(127mg,0.79mmol,1.2eq)。将该反应混合物搅拌1小时：通过tlc分析检测转化率(etoac100％)。在0℃向该反应混合物中加入异丁醇(1.0ml,10mmol)，在rt搅拌1小时。观察到痕量的期望的产物。然后将该反应混合物加热至50℃4小时：转化率增加。在50℃12小时后，通过tlc分析检测转化完成(己烷/etoac3/7)。真空蒸发溶剂，用etoac/h2o处理粗产物。用无水na2so4干燥采集的有机层，用硅胶垫纯化粗产物，得到化合物18(240mg,收率58％)。
lc-ms(esipos):634.2lc-ms
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm7.34(d,j＝8.82hz,2h),7.20-7.30(m,1h),7.04(d,j＝8.82hz,2h),6.21-6.37(m,1h),6.00-6.12(m,1h),5.47-5.72(m,2h),4.83-5.17(m,2h),4.10-4.29(m,2h),3.91(dd,j＝6.62,0.88hz,2h),3.43-3.60(m,1h),2.55-2.74(m,2h),2.04-2.29(m,3h),1.81-1.99(m,2h),1.64-1.76(m,1h),1.49(m,5h),0.81-0.96(m,9h).
如上述对化合物18所述、以己醇为原料制备化合物19：
实施例4
二甲基氨基甲酸酯2-[(4as,4br,5s,6as,6br,9as,10as,10bs,12s)-8-(4-氯-苯基)-4b,12-二氟-5-羟基-4a,6a-二甲基-2-氧代-2,4a,4b,5,6,6a,8,9,9a,10,10a,10b,11,12-十四氢-7-氧杂-8-氮杂-并戊二环烯并[2,1-a]菲-6b-基]-2-氧代-乙酯(化合物20)的制备
在rt向在ch2cl2(3ml)中的中间体2(310mg,0.58mmol)中分部分加入cdi(111mg,0.70mmol,1.2eq)。将该反应混合物搅拌1小时：通过tlc分析检测转化完成(etoac100％)。真空蒸发ch2cl2，将粗产物溶于thf(2ml)，然后在0℃加入2m二甲胺的thf溶液(1.15ml,2.32mmol)，在rt搅拌1小时。通过tlc分析检测转化完成(己烷/etoac2/8)。真空蒸发溶剂，用ch2cl2/h2o处理粗产物。用无水na2so4干燥采集的有机层，用硅胶垫纯化粗产物，然后将得到的黄褐色固体在己烷/乙酸乙酯混合物(8/2,8ml)中研磨1夜。在50℃真空干燥过滤的固体至恒重，得到化合物20(200mg,收率57％)。
lc-ms(esipos):605.2lc-ms
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm7.31-7.44(m,2h),7.21-7.30(m,1h),6.99-7.07(m,2h),6.20-6.43(m,1h),6.01-6.12(m,1h),5.47-5.76(m,2h),4.69-5.10(m,2h),4.08-4.25(m,2h),3.43-3.59(m,1h),2.80-3.00(m,6h),2.55-2.72(m,2h),2.03-2.28(m,3h),1.83-1.96(m,1h),1.65-1.81(m,1h),1.49(m,5h),0.93(s,3h).
如上述对化合物20所述、以甲胺为原料制备化合物21：
实施例5
哌嗪-1-甲酸2-[(4as,4br,5s,6as,6br,9as,10as,10bs,12s)-8-(4-氯-苯基)-4b,12-二氟-5-羟基-4a,6a-二甲基-2-氧代-2,4a,4b,5,6,6a,8,9,9a,10,10a,10b,11,12-十四氢-7-氧杂-8-氮杂-并戊二环烯并[2,1-a]菲-6b-基]-2-氧代-乙酯(化合物22)的制备
在rt向在thf(3.5ml)中的中间体2(500mg,0.94mmol)中分部分加入cdi(180mg,1.12mmol,1.2eq)。将该反应混合物搅拌1小时：通过tlc分析检测完全转化为活化的中间体(己烷:etoac3/7)。将该反应混合物冷却至10℃，然后加入哌嗪-1-甲酸叔丁酯(174mg,0.94mmol,1.0eq)，在rt搅拌过夜。通过tlc分析检测转化率(己烷/etoac3/7)。真空蒸发溶剂，用etoac/h2o处理粗产物。用无水na2so4干燥采集的有机层，将粗化合物中间体3不经进一步纯化用于下一步(260mg,收率37％)。
将中间体3(260mg,0.35mmol)在ch2cl2(5ml)中的溶液冷却至0℃，向其中滴加三氟甲磺酸三甲基-甲硅烷基酯(63μl,1.0eq,)。将该反应混合物在0℃搅拌1小时，然后用脱矿质水猝灭。用nahco3饱和溶液、然后用去矿质水洗涤有机层，用无水na2so4干燥，得到粗化合物，通过硅胶柱色谱法纯化(用etoac/tea99:1洗脱)，在50℃真空干燥至恒重，得到化合物22(190mg,84％收率)。
lc-ms(esipos):646.4mh+
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm7.33(d,j＝8.82hz,3h),7.03(d,j＝8.82hz,2h),6.19-6.39(m,1h),6.07(s,1h),5.46-5.76(m,2h),4.76-5.14(m,2h),4.05-4.28(m,2h),3.41-3.60(m,1h),3.18-3.30(m,5h),2.66(m,6h),1.95-2.28(m,3h),1.81-1.95(m,1h),1.57-1.79(m,1h),1.48(m,5h),0.93(s,3h).
如上述对化合物22所述、以相应的中间体为原料制备下表中列出的化合物：
说明
*nmr
s＝单峰
d＝双峰
t＝三重峰
q＝四重峰
dd＝双组双重峰
m＝多重峰
br＝宽峰
esi-pos＝电喷雾正电离
lc-ms＝液相色谱法-质谱法
本发明化合物的药理学活性
体内研究
实施例6
脂多糖(lps)-诱导的肺中性白细胞增多症
按照稍做修改的am.j.respir.crit.caremed.第162卷.pp1455-1461,2000中所述的方法，在急性肺部炎症模型中体内评价本发明中所述化合物的效能和作用期限。
试验对sprague-dawley雄性大鼠(200g)进行。
气管内滴入lps导致balf中嗜中性粒细胞浓度具有统计学显著性增加，即急性进行性肺炎症的标志。
对于产生75％抑制(ed75剂量)的评价试验的糖皮质激素剂量，在lps攻击前1小时，在气管内施用作为混悬液(0.2％tween80的nacl0.9％溶液)的化合物(0.01-1μmoles/kg体重)。
完成测试化合物对lps-诱导的肺中性白细胞增多症的抑制作用的剂量-响应曲线，并且在本生物测定中将糖皮质激素的ed50剂量取为效能测量值。一些本发明有代表性的化合物的ed50剂量值包含0.05－0.16μmoles/kg体重。
在第二个系列的目的在于作用期限评价的实验中，在lps攻击前24h，在气管内以ed75剂量施用作为混悬液的化合物。在lps攻击前24小时施用时，最有意义的化合物具有活性(抑制百分比高于50％)。
体内研究
实施例7
糖皮质激素受体(gr)易位测定方案
根据assaydrugdevel.technol.,4(3),263-272,2006，通过由discoverx(fremont,ca)研发的酶片段互补(enzymefragmentcomplementation)(efc)形式中新的基于细胞的gr-易位测定对本发明化合物gr的核转位进行定量测定。
在没有糖皮质激素存在下，糖皮质激素受体(gr)居留在与各种蛋白质包括热激蛋白复合的胞质溶胶中。
当糖皮质激素通过细胞膜扩散入细胞质并且结合糖皮质激素受体(gr)时，它导致热激蛋白释放并且转位入核，在那里它调节基因转录。
discoverx测定使用b-半乳糖苷酶(b-gal)的efc作为改造的cho-k1生物传感器细胞中gr-易位的指示剂。正如所设计的，通过使用专有的组序列添加和修饰，b-gal的酶受体(ea)片段居留于核中。使b-gal的小肽酶供体(ed)片段直接与gr的c-末端融合并且在没有受体信号传导的存在下定位于细胞质中。在结合gr配体时，该复合物转位于核，其中完整的酶活性因互补被恢复并且检测到b-gal活性。
在37℃在包含5％co2和95％空气的加湿气氛中将稳定表达b-gal的nls-酶受体片段(ea)和b-gal的gr-酶供体(ed)片段的cho-k1细胞维持在f12培养基(invitrogen,carlsbad,ca)中。所述培养基包含10％fbs、2mml-谷氨酰胺、50u/ml青霉素、50μg/ml链霉素和250μg/ml潮霉素和500μg/mlg418(invitrogen)。
使用包含细胞膜渗透试剂和β-gal底物的pathhunter检测试剂盒(discoverx,fremont,ca)测定gr-易位。使用10-11－10-6m的不同浓度筛选所有化合物。本测定在48-孔(105细胞/孔)中进行。与筛选的化合物一起在37℃温育2小时。通过添加来自由discoverx提供的试剂盒的检测缓冲液并且在rt温育1小时进行检测。通过使用centrolb960微量培养板读出器(bertholdtechnologies)检测发光。
通过使用prism-3.0版graphpad软件(sandiego,ca)进行统计学分析和ec50s测定。
使用gr易位测定的本发明的一些有代表性的化合物展示出包含3.2nm－207nm的ec50。
实施例8
raw264.7巨噬细胞中lps-诱导的一氧化氮产生的抑制
基于巨噬细胞鼠细胞raw264.7系的体外模型用于测试本发明皮质类固醇的抗炎作用。
在抗炎过程中，通过no合酶的诱导型同种型(inos)生成大量一氧化氮(no)。细菌脂多糖(lps)常用于实验环境以刺激巨噬细胞中炎症应答。
使细胞生长在无酚红的培养基(补充了热灭活的10％胎牛血清、2mm谷氨酰胺、100u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的rpmi)中。通过将细胞与lps一起温育24小时至约100ng/ml的终浓度引起细胞刺激。在lps暴露前15分钟，通过在dmso媒介物中(0.1％终浓度)添加本发明的化合物至这样的化合物的最终期望浓度来进行处理。作为一氧化氮产生指标，通过使用griess比色反应(j.neuroimmunol.,150,29-36,2004)测定条件培养基中亚硝酸盐浓度。
通过使用prism-版3.0graphpad软件(sandiego,ca)进行统计学分析和ic50s测定。对本发明一些有代表性的化合物测试的ic50值包含12.2－151nm。
实施例9
白细胞介素-8(il-8)释放测定方案
为了评价新吸入的皮质类固醇的抗炎作用，我们评价了这些化合物在抑制tnfα-诱导的il-8从人气道平滑肌细胞(asmcs)中释放中的选择性。
暴露于各种炎症介体(肿瘤坏死因子(tnf)-α或il-1β)的hasmcs可以发生表型改变并且分泌趋化因子和细胞因子，它们可以通过活化和募集炎症细胞参与乃至保持粘膜炎症改变(damera等人2009；howarth等人,2004；chung,2000；koyama等人,2000)。
目前的证据启示由炎症介体诱导的趋化因子和细胞因子分泌被hasmcs和肺成纤维细胞中的糖皮质激素抑制(john等人1998；spoelstra等人,2002；tobler等人,1992)。类固醇可以通过活化糖皮质激素受体与活化转录因子之间的直接抑制性相互作用抑制细胞因子-诱导的趋化因子分泌，所述转录因子例如为核因子-κb和激活蛋白-1，它们调节炎症基因表达。此外，糖皮质激素可以通过经p38map激酶mkp-1(为类固醇反式激活的基因之一)的有效内源性抑制剂的快速诱导降低mrna稳定性来调节趋化因子表达(king等人,2009)。
初级人气道平滑肌细胞(asmcs)购自lonza(basel,ch)并且在37℃在95％空气和5％co2气氛中在补充了10％胎牛血清、2mm谷氨酰胺、100u青霉素和100μg/ml链霉素(invitrogen)的dmem培养基中培养。
将asmc以104细胞/孔的密度接种在48-孔组织培养板内包含10％fbs的0.5mldmem中并且使其在37℃与5％co2下生长24小时。然后将细胞进行血清饥饿18小时，然后用不同浓度的lagra处理(10-12m-10-6m,最终dmso浓度0.1％)60min，然后用tnfα刺激(0.1ng/ml作为asmcs的终浓度)。在不含血清的dmem中18小时温育后，使用elisa试剂盒(invitrogen)测定上清液中il8的释放。将化合物效能表示为在用tnfα刺激后得到的剂量-响应曲线中能够抑制半数最大(50％)il8释放[ic50]的浓度。
全部所述数值为平均值±平均值的标准误差(sem)。化合物效能(表示为半数最大(50％)抑制浓度[ic50])衍生自使用prism软件的4-参数非线性迭代曲线-拟合分析(graphpadsoftware,sandiego,ca)。通过使用prism软件(graphpadsoftware,sandiego,ca)进行统计学分析、s形曲线设计和分析。