一种改组纤维素酶基因及其表达载体和应用的制作方法

文档序号：16207870发布日期：2018-12-08 07:20阅读：303来源：国知局

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种改组纤维素酶基因及其表达载体和应用。

背景技术

粗纤维是作物秸秆的主要成分，包括大分子多糖纤维素、单糖异构多聚体半纤维素和芳香性高聚物木质素。纤维素在空间按照一定的方式排列组合构成了细小的维管束结构，错综复杂的维管束构成了网状形态的胞壁。普通的作物秸秆中含有质量分数70％—85％的粗纤维，除此外，农作物秸秆还含有少量其它物质，如5％的灰分(成分主要为二氧化硅，密集分布在秸秆表层)、2-8％的粗蛋白、1-2％的脂类、10％的水分等。

纤维素是天然的高分子化合物，聚合着大量单糖，构成了作物秸秆的主要营养成分，常见由1000左右的c6h10o5结构单元构成。其分子结构是用大量β-d-吡喃葡萄糖基(1-4)-β-糖苷键链接形成的。纤维素分子通常以聚集状态存在，有结晶区域和非结晶区之分，两区域是逐渐过渡的，没有明显的界限。结晶区的特征在于纤维素与纤维素之间的分子取向性良好，结构紧凑，内部致密，整体强度大；非结晶区分子排列不规则，间距大，致密度不高，分子间的氢键数较少。由于纤维素分子链的“网络状”结构，纤维素具有与有机溶剂和水不相容的特性。

而粗纤维是作物秸秆的主要成分，秸秆微贮用作动物饲料过程中普遍存在的问题是生物发酵使秸秆的适口性虽提高了，但消化率却无明显的改善，这主要是由于菌与酶的协同性差所致，大多数微生物在秸秆微贮的强酸性环境中产生的酶活性较低。另外，在秸秆处理过程中直接加入纤维素酶虽然提高了秸秆的利用率，但却使成本大大提高，在生产中又难以推广应用。

综上所述，秸秆中的纤维素作为饲料时，利用率较低，无法在较低的成本下提高秸秆的利用率，而且在酸性环境下酶活性较低，亟待进一步改进。

技术实现要素：

本发明提供一种蛋白质，为如下(a)或(b):

(a)所述蛋白质的氨基酸组成序列如seq.1所示；

(b)将(a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有纤维素酶活性的由seq.1衍生的蛋白质。

优选的，所述蛋白质的氨基酸组成序列如seq.2所示。

编码seq.1所示的蛋白质的基因也是本发明的保护范围。

扩增上述所述基因的引物对，所述引物对的正向引物为seq.5所示，反向引物如seq.6所示；所述引物对的正向引物为seq.7所示，反向引物如seq.8所示。

上述所述的基因为如下(1)或(1)或(3)：

(1)编码区如seq.3所示的dna分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的dna序列杂交且编码具有纤维素酶活性蛋白质的dna分子；

(3)与(1)或(2)限定的dna序列至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有纤维素酶活性蛋白质的dna分子。

优选的，上述所述基因序的碱基序列如seq.4所示。

含有上述所述的基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

优选的，所述的重组载体为pmd19-载体、pmg36e载体。

优选的，所述的重组菌为植物乳酸杆菌体。

本发明还提供一种构建上述所述的植物乳酸杆菌的方法，其包括

以康氏木霉或黑曲霉中的纤维素酶基因为模板进行扩增，通过将扩增基因进行片段化、无引物pcr、有引物pcr对纤维素酶进行改组，并将改组的纤维素酶基因构建重组载体，将该重组载体转化植物乳杆菌中，形成改组纤维素酶基因重组植物乳酸杆菌。

本发明具有如下优点：

本发明利用定向进化的方法对酶基因进行改组，并获得酶活较高的纤维素酶基因，把纤维素酶基因转入到乳酸杆菌中，当转基因的乳酸杆菌在秸秆中大量生长和繁殖的同时，可分泌大量的纤维素酶，从而达到分解秸秆中纤维素的目的。本发明的重组植物乳酸杆菌不仅提高了发酵秸秆的适口性，而且也提高了秸秆的营养价值，同时也避免了在秸秆处理过程中添加纤维素酶，大大地降低了生产成本。

附图说明

图1为本发明的pcr扩增得到的康氏木霉及黑曲霉的纤维素酶基因的电泳图，其中，1：黑曲霉特异性引物扩增结果；2：康氏木霉特异性引物扩增结果。

图2为本发明的pmd19-t载体重组克隆的蓝白斑筛选结果照片图。

图3为本发明的dnaseⅰ处理的纤维素酶基因片段，其中，1：纤维素酶混合片段f1；2：纤维素酶混合片段f2。

图4为本发明的纤维素酶基因的有引物pcr，其中，1，3：黑曲霉特异性引物扩增结果；2，4：康氏木霉特异性引物扩增结果。

图5为本发明的表达质粒pmg36e的图谱。

图6为本发明的表达载体pmg36e双酶切结果。

图7为本发明的重组表达载体pmg36e-cbhⅰ质粒鉴定，其中，1，2：改组i；3，4：改组ⅱ；5：pmg36e。

图8为本发明的葡萄糖标准曲线图。

图9为本发明的滤纸酶酶活随温度变化曲线图。

图10为本发明的滤纸酶酶活随ph变化曲线图。

图11为本发明中，原始植物乳酸杆菌和本发明的重组植物乳酸杆菌培养上清液的sds-page电泳结果图，其中，m：蛋白maker；1、3：本发明的重组植物乳酸杆菌培养上清液；2、4：原始植物乳酸杆菌培养上清液。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

本实施例采用黑曲霉及康氏木霉为实验室保存菌种，大肠杆菌dh5α及克隆质粒pmd19-t购自takara公司。pcr扩增引物设计，从ncbi中查得黑曲霉及康氏木霉的基因全序列，并在cbhⅰ基因的编码区信号肽序列的下游开始设计引物，在正向引物加入xbaⅰ酶切位点，反向引物加入pstⅰ酶切位点，反向引物5’端分别加上保护性碱基gc、ccg(此引物由上海生工生物工程股份有限公司合成)。

康氏木霉引物：

正向引物k1如seqno.5所示：5'-gctctagaatgtatcggaagttggccgtcxbaⅰ

反向引物k2如seqno.6所示：5'-ccgctcgagttacaggcactgagagtagtapstⅰ

黑曲霉引物：

正向引物h1如seqno.7所示：5'-gctctagaatgcatcaacgtgcccttctcttttxbaⅰ

反向引物h2如seqno.8所示：5'-ccgctcgagttatgcggaagcgctgaaggtcgagtpstⅰ

实施例2纤维素酶基因的pcr扩增

将康氏木霉、黑曲霉分别接种于pda培养基中，30℃下120rpm摇床培养48h，用无菌滤纸过滤菌体并吸干水分，使用rna提取试剂盒提取康氏木霉、黑曲霉的的总rna。

其中，pda培养基配制，称取mgso40.15g，可溶性淀粉3g，葡萄糖10g，kh2po41g，酵母浸粉1g，胰蛋白胨2.5g，溶于400ml的蒸馏水中，充分搅拌溶解，用蒸馏水定容至500ml。121℃、1.05×10⁵pa高压蒸汽灭菌20min，备用。

纤维素酶基因的cdna文库建立，用dnaseⅰ处理总rna，37℃反应20-30min，后于pcr仪里80℃灭活10min；在微管中按表1配置以下体系。

表1反转录反应体系(μl)

(3)70℃保温10min后迅速冰上急冻2min以上；

(4)离心数秒后在上述微管中按表2配置以下溶液；

表2反转录反应体系(μl)

(5)42℃保温1h；

(6)70℃保温15min后冰上冷却，得到的cdna用于pcr扩增。

以上述cdna为模板，k1、k2/h1、h2分别为引物，加入rnasefreewater及2×estaqmastermix，用涡旋振荡仪进行混匀并进行pcr扩增。反应体系为50μl，组成见表3。

表3为两种纤维素酶基因pcr反应体系(μl)

pcr反应条件如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，60-63℃(根据纤维素酶基因不同有所差异)30s，72℃延伸80s，35个循环；72℃延伸10min。反应结束后用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，如图1所示，pcr扩增得到的康氏木霉及黑曲霉的纤维素酶条带清晰，位置及大小与对应纤维素酶基因一致，选择pcr产物条带大小符合预期的进行下步试验。

实施例3纤维素酶基因的连接转化

纤维素酶基因与pmd19-载体的连接，按照表4配置纤维素酶基因pcr回收产物的连接体系，4℃连接过夜。

表4pcr产物与pmd19-t载体连接反应体系(μl)

将生长良好的大肠杆菌平板放置于4℃冰箱内，显色数小时。如图2所示，不含重组质粒的大肠杆菌有β-半乳糖苷酶的活性，菌落中央为淡蓝色，外周呈现深蓝色；而含有重组质粒的大肠杆菌无β-半乳糖苷酶的活性，菌落呈现乳白色，以进行初步筛选。

基因准备，对已经测序完成的纤维素酶基因进行pcr扩增，并使用琼脂糖纯化回收试剂盒回收pcr产物，得到纤维素酶基因。

实施例4纤维素酶基因的片段化及无引物pcr

纤维素酶基因的片段化，dnaseⅰ内切酶反应条件的确定，将dnaseⅰ内切酶用灭菌后的去离子水稀释至0.07u/μl，按照表5配置反应体系，在15℃分别反应5、10、15、20min后，80℃灭活10min。通过1％琼脂糖凝胶电泳检测基因片段大小。

表5dnasei酶切反应体系(μl)

基因片段化，按照表5配制纤维素酶基因片段化反应体系，通过2％琼脂糖凝胶电泳检测片段化效果，酶切结果如图3所示，利用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒回收纤维素酶基因片段。

表6dnasei酶切反应体系(μl)

无引物pcr，以得到的纤维素酶基因片段为模板，按表7配置反应体系，进行无引物pcr，反应条件如下：94℃5min，之后94℃30s，63℃30s，72℃80s进行45个循环，最后72℃延伸10min。然后通过1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，并回收产物。

表7纤维素酶基因片段无引物pcr反应体系(μl)

有引物pcr，以pcr反应产物为模板，分别加入特异性引物，按表8配置反应体系，进行有引物pcr扩增，反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60-63℃(根据纤维素酶基因引物不同有所差异)30s，72℃延伸80s，35个循环；72℃延伸10min。然后用1％琼脂糖凝胶电泳检测，并回收有特异性的产物，如图4所示，纤维素酶基因的有引物pcr，可以得到与黑曲霉纤维素酶基因大小相同的专一条带(改组i号，改组ⅱ号)，而没有与康氏木霉纤维素酶基因大小相同的专一条带出现。

表8纤维素酶基因有引物pcr反应体系(μl)

改组纤维素酶基因与pmd19-t载体的连接，将回收的pcr产物按表9配置连接体系，4℃连接过夜。

表9pcr产物与pmd19-t载体连接反应体系(μl)

实施例5纤维素酶cbhⅰ改组基因真核表达载体的构建

本实施例采用表达质粒pmg36e构建真核表达载体，如图5所示，改组纤维素酶基因及真核表达载体pmg36e质粒的纯化和回收使用质粒提取试剂盒提取两种改组基因，并使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒载体。

如图6所示，表达载体pmg36e双酶切结果，使用对应的限制性内切酶对重组质粒载体和pmg36e空质粒载体分别进行双酶切。37℃酶切过夜，并通过1％琼脂糖凝胶电泳对酶切结果进行检测，然后用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒回收双酶切后的两种改组基因及pmg36e质粒。

改组纤维素酶基因与真核表达载体pmg36e质粒的连接，将改组纤维素酶基因与真核表达载体pmg36e质粒进行连接，16℃反应16-18h。

连接产物转化大肠杆菌dh5α及重组转化子的筛选，将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞中，使用的培养基为含200μl/ml红霉素的lb培养基。真核表达载体pmg36e质粒中含有抗红霉素的基因片段，如果目的基因与表达载体连接成功并转入大肠杆菌，就可以在含有红霉素的培养基中生长，进行初步筛选。使用sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒提取重组质粒，并用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

利用菌液pcr检测转化的乳酸菌，用无菌接种环挑取生长较好的植物乳酸杆菌单菌落，接种到含有红霉素的mrs培养基及对应编号的含8μl无菌水的无菌微量离心管中，前者37℃静置培养48h；后者在95℃处理10min后，再添加预混酶及反向引物进行pcr扩增，再进行琼脂糖凝胶电泳检测，初步测定植物乳杆菌菌落是否含有目的基因，将扩增出目的条带的pcr产物送至上海生工进行测序，改组ⅰ号的纤维素酶基因序列为seq.3所示，该基因完整的开放阅读框1365bp，编码454个氨基酸，氨基酸序列如seq.1所示，改组改组ⅱ号的纤维素酶基因序列如seq.4所示，该基因完整的开放阅读框1365bp，编码454个氨基酸，氨基酸序列如seq.2所示。如图7所示，重组表达载体pmg36e-cbhⅰ质粒鉴定。

实施例6sds-page检测目的蛋白

(1)上清液样品制备

挑取重组植物乳酸杆菌单菌落接种于10mlmrs液体培养基中，37℃静置培养过夜。取100μl过夜培养物转接于100mlmrs液体培养基，37℃静置培养3天，收集发酵培养物，12000rpm离心5min，取上清液作为蛋白样品。

(2)sds-page凝胶的配制

制胶前需要用自来水和去离子水对电泳槽进行彻底清洗，直到玻璃板非常干净无任何污渍。一旦玻璃上留有油脂等污物，在制胶的过程中极易产生气泡。具体方法如下：量取100ml甲醇溶解5g氢氧化钠，将玻璃板置入其中浸泡，然后用热的去污剂清洗一遍，再分别用自来水和去离子水洗涤，最后用乙醇清洗。组装电泳槽时需佩戴一次性手套。按表10所列成分配制凝胶。

表10sds-page凝胶配制成分(ml)

沿玻璃板边缘用移液枪将新鲜配制的分离胶缓缓注入两块玻璃板之间，一定要避免产生气泡。在距离上沿约2cm处停止注入胶液。用1ml注射器小心轻柔地将蒸馏水注入胶面上，用来阻隔空气。然后在室温下静置30min左右以使胶液聚合，待分离胶面和水面之间呈现一条清晰可见的水线时，表示聚合完成。分离胶聚合后，倾倒去上边的水层，用滤纸吸干残存的水。再用移液枪将新鲜配制的浓缩胶缓缓地先注入少量于分离胶上层，插入电泳梳子(提前用水洗净，用酒精棉球擦洗，晾干)，梳子下沿距分离胶上沿约1cm，注意放置梳子时不要产生气泡。然后用注射器缓慢地补充浓缩胶，直至完全淹没梳子，等到聚合后小心拔去梳子，加入电泳缓冲液。接通电源。

(3)电泳样品的处理及电泳条件

将浓缩后的粗酶液样品与样品缓冲液等量混匀，100℃煮沸3-5min，冷却至室温，1500rpm离心2min，取15μl点样。

先将电压设为80v，待样品完全通过浓缩胶之后，将电压调高至8-15v/cm胶直到电泳结束，期间需要不断补充电泳缓冲液。

(4)染色及脱色

小心从电泳玻璃板上将跑好的胶从玻璃板上取下，放入染色盒中，加入约5倍体积的染色液浸泡，放在平缓摇动的摇床中室温染色过夜。倒掉染色液，用脱色液冲洗一下后，将凝胶浸泡于脱色液中，平缓摇动，每3h换一次脱色液，直至脱色完全，有明显的蛋白条带为止。

蛋白电泳检测结果，如图11所示，原始和重组植物乳酸杆菌培养上清液的sds-page电泳结果，从图中可以看到分子量约为49.8kda的蛋白条带，与理论大小相符，而对照组则没有，这表明改组的纤维素酶cbhⅰ基因成功转入植物乳酸杆菌中，并且得到了分泌型表达。

实施例6重组植物乳杆菌纤维素酶活性的测定

重组植物乳杆菌纤维素酶活性的测定，粗酶液的制备，挑取重组植物乳杆菌单菌落接种于10mlmrs液体培养基中，37℃静置培养48h。(2)按2％接种量将上述培养物分别接种于含5％秸秆的低糖mrs和无糖mrs液体培养基中，37℃静置培养，每24h取样，12000rpm离心5min，取上清液作为粗酶液，连续收集7d。

纤维素酶活力测定，(1)葡萄糖标准曲线的制作，称取经105℃烘至恒重的无水葡萄糖1.0000g，加柠檬酸盐缓冲液溶解，定容至100ml，充分混匀，配置成10mg/ml的葡萄糖标准溶液。分别量取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00ml的葡萄糖标准溶液，并用柠檬酸盐缓冲液分别定容至50ml，制成浓度为0.00-1.600mg/ml的葡萄糖标准系列。

分别吸取上述葡萄糖标准溶液各1.00ml于25ml刻度试管中，各加2.00ml蒸馏水和2.00mldns试剂，沸水浴5min，冷却至室温并定容至25ml，在540nm波长下测定光密度值。以吸光度为横坐标，对应的葡萄糖标准溶液含糖的毫克数为纵坐标，绘制出葡萄糖标准曲线，见图8。

实施例7重组植物乳杆菌纤维素酶活性测定

重组植物乳杆菌纤维素酶活性测定结果，滤纸酶测定结果，滤纸酶活测定结果如表10。原始植物乳酸杆菌酶活性为0.00u/l。从表中可以看出在低葡萄糖mrs培养基中滤纸酶活转入改组i号纤维素酶基因的植物乳杆菌酶活最高可达4.83u/l，转入改组ii号纤维素酶基因的植物乳杆菌酶活最高可达4.19u/l。

表10低葡萄糖mrs培养乳酸杆菌的纤维素酶酶活(u/l)

注：同列用大写字母不同表示差异显著(p<0.05)，同行小写字母不同表示差异显著(p<0.05)。

改组纤维素酶酶学性质分析结果，重组植物乳杆菌纤维素酶活受温度的影响结果见图9所示，由图中看出，改组1号、改组2号上清液中纤维素酶最适反应温度均为50℃。在30-50℃之间，酶活随着温度升高而升高，当温度继续升高时，酶活力都下降，温度上升至60℃以后，酶活下降的比较缓慢，可能是温度偏高造成部分酶失活。

重组植物乳杆菌纤维素酶活随ph的变化曲线见图10，从该图中可以看出改组1号上清液中纤维素酶最适反应ph为5.0，改组2号上清液中纤维素酶最适反应ph为5.5。

本发明从高产纤维素酶菌康氏木霉及黑曲霉出发，对其中的纤维素酶基因进行dna改组，并将改组后基因通过表达载体pmg36e电击转化进植物乳酸杆菌，成功的构建了植物乳酸杆菌重组菌，对重组植物乳酸杆菌产纤维素酶性质分析结果显示，其最适反应温度在50℃，最适反应ph在5.0-5.5。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>河南农业大学

河南德邻生物制品有限公司

<120>一种改组纤维素酶基因及其表达载体和应用

<130>20180605

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>454

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

methisglnargalaleuleupheseralaleuleuthralavalarg

151015

alaglnglnalaglythrleuthrglugluvalhisproserleuthr

202530

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505560

thrasncystyrthrglyasnthrtrpaspalathrleucysproasp

65707580

aspgluthrcysalaalaasncysalaleuaspglyalaasptyrglu

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serthrtyrglyilethrthraspglyaspserleuthrleulysphe

100105110

valthrglyserasnvalglyserargleutyrleumetaspthrser

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aspvalaspvalserasnleuprocysglyleuasnglyalaleutyr

145150155160

phethralametaspalaaspglyargalaserlystyrproalaasn

165170175

lysalaglyalalystyrglythrglytyrcysaspserglncyspro

180185190

argaspleulyspheileaspglyglnglualaasnvalaspglytrp

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210215220

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290295300

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305310315320

lysarghistyrvalglnasnglyasnvalilealaasnalaaspser

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<210>4

<211>1365

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4