一种立体选择性提高的菜豆环氧化物水解酶突变体的制作方法

本发明涉及一种立体选择性提高的菜豆环氧化物水解酶突变体，属于基因工程和蛋白质表达领域。

背景技术：

环氧化物水解酶(epoxidehydrolases,ehs)能催化外消旋环氧化物的对映归一性水解，将底物完全转化为相应的单一构型，具有具有来源广、对映选择性和区域选择性较高、不需要辅助因子参与、反应条件温和、对环境友好等优点，环氧化物水解酶所介导的较为专一的立体选择性而逐渐走进人们的视野，被认为是一种极具工业应潜力的生物催化剂。环氧化物水解酶(epoxidehydrolases,ehs,ec3.3.2.-)能够催化外消旋环氧化物的水解动力学拆分或对映归一性水解，保留单一构型环氧化物或转化为手性邻二醇。该反应的立体化学结果与酶对底物的立体选择性(包括对映选择性与对映归一性)紧密相关：具有对映选择性的ehs快速催化某一构型环氧化物的水解反应，得到相应的产物邻二醇以及保留另一构型环氧化物，即进行酶促动力学拆分。其中，ehs对外消旋环氧化物的对映选择率e决定环氧化物的对映体纯度。若继续反应，另一构型环氧化物也会被水解，即进行酶促对映归一性水解。底物完全转化时，区域选择性系数决定最终产物邻二醇的对映体纯度。环氧化物和邻二醇的对映体纯度通常用对映体过量值ee评价，分别表示为ees和eep。

手性化合物具有不同于外消旋体的独特性质，其在生物体内的代谢途径、代谢速率、药理及毒性等方面的差异，使其在化学和生命科学产业有着崭新和特殊的用途。对映纯间氯环氧苯乙烷(mcso)与其水解产物对氯苯乙二醇(mcped)是多种手性药物与功能材料的重要中间体。同时对映纯对氯环氧苯乙烷(pcso)与其水解产物对氯苯乙二醇(pcped)是多种手性药物与功能材料的重要中间体，如r型对氯环氧苯乙烷((r)-pcso)可以用于合成cb1拮抗剂；r型对氯苯乙二醇((r)-pcped)是nmda受体抑制剂——依利罗地的重要手性砌块。目前，一系列合成对映纯pcso与pcped的生物化学方法已经被报道。其中，suresh等人利用一类手性大环席夫碱类化合物催化对氯苯乙烯加氧合成(r)-pcso，其eep最高可达47％；karboune等人利用来自重组黑曲霉(aspergillusniger)的环氧化物水解酶(aneh)水解外消旋对氯环氧苯乙烷制备(r)-pcso，当转化率达到51％时，ees为87％并保留s型底物；manoj等人使用两种对映选择性互补的eh(steh与aneh)协同水解外消旋pcso合成(r)-pcped，eep达到93％。利用ehs催化制备(r)-pcso与(r)-pcped与席夫碱催化合成相比，具有eep高，来源清洁，更易分离等优势。

由于植物来源的eh更加容易获得且原料也较为廉价，引发了人们的研究兴趣。迄今报道的具有单一对映归一性催化特性的环氧化物水解酶有三种，分别来源于土豆、绿豆和新月柄杆菌。本实验室从菜豆(phaseolusvulgaris)克隆了一种环氧化物水解酶(pveh1)，并实现其在大肠杆菌e.colibl21(de3)中异源表达。但该重组酶对环氧化物的对映选择性并不高，从而限制了其在高附加值药物前体的手性合成中的应用潜力。随着基因工程技术和高通量筛选技术的发展，对已知的环氧化物水解酶进行定向改造是丰富此类酶的重要途径。通过同源建模分析该酶的蛋白质结构，并通过定点突变技术对pveh1进行分子改造，提高其对映归一性，将其更好的应用于工业生产。

技术实现要素：

为了更好地将pveh1应用于对映纯的环氧化物与邻二醇的工业生产，本发明通过理性设计，获得了立体选择性提高的pveh1突变体。本发明采用全质粒pcr的方法以e.colibl21(de3)/pet28a(+)-pveh1^{l105i/m160a/m175i}质粒为模板，将第178位氨基酸突变成苏氨酸、第106位氨基酸突变成异亮氨酸、同时将第184位氨基酸突变成色氨酸。获得了立体选择性和催化活性同时提高的突变酶，解决了立体选择性不能满足生产高对映纯环氧化物与邻二醇的需求，为拓宽pveh1的工业应用奠定了基础。

本发明的第一个目的是提供一种环氧化物水解酶pveh1的突变体，所述突变体含有seqidno:1所示的氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供编码所述环氧化物水解酶突变体的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因含有seqidno.2所示的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供含有所述基因的载体。

本发明的第四个目的是提供表达所述突变体的细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞包括真菌细胞或细菌细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞包括大肠杆菌、酵母或枯草芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞是大肠杆菌e.colibl21(de3)。

本发明的第五个目的是通过理性设计，以seqidno.3所示酶的氨基酸序列为出发序列，将第178位氨基酸突变成苏氨酸、第106位氨基酸突变成异亮氨酸、同时将第184位氨基酸突变成色氨酸。

本发明的第六个目的是提供所述突变体的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是以所述突变体为催化剂，制备对氯环氧苯乙烷。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是催化包括间氯环氧苯乙烷在内的环氧化物。

本发明的有益效果：

通过理性设计获得对映选择性与对映归一性(即立体选择性)提高的突变酶pveh1z4x4-59对外消旋间氯环氧苯乙烷的催化效率。本发明制备的突变酶pveh1z4x4-59对外消旋对氯环氧苯乙烷(rac-pcso)的e值从3.6提高至26.5。同时，与野生型相比，pveh1z4x4-59对外消旋对间环氧苯乙烷(rac-mcso)的最终eep，在25℃下从3.1％提高到92.3％。

附图说明

图1为全质粒pcr的凝胶电泳图。

图2为rac-pcso动力学拆分图。

图3为全细胞催化rac-pcso进程图。

具体实施方式

实施例1突变质粒的构建

1、质粒pet28a(+)-pveh1^{l105i/m160a/m175i}的获得

将重组菌e.colibl21(de3)/pet28a(+)-pveh1^{l105i/m160a/m175i}(构建方法参加见论文huihy,dieh,xiaols,etaldirectedmodificationofanovelepoxidehydrolasefromphaseolusvulgaristoimproveitsenantioconvergencetowardsstyreneepoxides[j].catalysiscommunications,2016：32-35)接种于培养基装液量为5ml试管中于37℃、220rpm振荡培养12h。培养结束后，将菌体于13,000rpm下离心1min并收集细胞，利用高纯度质粒小提试剂盒pureplasmidminikit(购于康为试剂有限公司)从e.colibl21(de3)/pet28a(+)-pveh1^{l105i/m160a/m175i}中提取质粒作为迭代突变的模板，进行质粒pet28a(+)-pveh1^{l105i/m160a/m175i}的构建。

2、重组大肠杆菌e.colibl21(de3)/pet-28a(+)-pveh1(pveh1z4x4-59)的构建

设计特异性的引物，进行单点迭代突变。设计并合成特异性定点突变引物如下：

s178-f：5-tactactgtaccaagtttggcaagacg-3'，含突变位点；

s178-r：5-cgtcttgccaaacttggtacagtagta-3'，含突变位点；

l106-f：5-gcctgcgctatcgtgagctgctacaccatc-3'，含突变位点；

l106-r：5-gatggtgtagcagctcacgatagcgaggc-3'，含突变位点；

p184-f：5-ttgcctgcgtggctacggagactgcgatg-3'，含突变位点；

p184-r：5-catcgcagtctccgtagccacgcaggcaa-3'，含突变位点；

(1)以s178-f：、s178-r为上下游引物，以pet28a(+)-pveh1^{l105i/m160a/m175i}为模板(公开于如下论文中：huihy,dieh,xiaols,etaldirectedmodificationofanovelepoxidehydrolasefromphaseolusvulgaristoimproveitsenantioconvergencetowardsstyreneepoxides[j].catalysiscommunications,2016：32-35)，利用quickchangetm试剂盒进行pcr，转化escherichiacolibl21(de3)利用质粒提取试剂盒获得重组质粒pet28a(+)-pveh1^{l105i/m160a/m175i/s178t}；(2)v106-f、v106-r为上下游引物，以pet28a(+)-pveh1^{l105i/m160a/m175i/s178t}为模板，利用quickchange^tm试剂盒进行pcr，转化e.colibl21(de3)，利用质粒提取试剂盒获得重组质粒pet28a(+)-pveh1^{l105i/m160a/m175i/s178t/v106i}；(3)p184-f、p184-r为上下游引物，以pet28a(+)-pveh1^{l105i/m160a/m175i/s178tv106i}为模板，利用quickchange^tm试剂盒进行pcr，转化e.colibl21(de3)，利用质粒提取试剂盒获得重组质粒pet28a(+)-pveh1^{l105i/m160a/m175i/s178t/v106i/p184w}；pcr条件如下：预变性95℃，4min；变性98℃，10s；退火55℃，15s；延伸72℃，8min；从变性到延伸循环30次，最后充分延伸72℃，10min。体系为25μl，以野生型pveh1的质粒为模板。

pcr完成后，加入0.5uldpni(dpni酶购于宝生物工程(大连)有限公司)及1ul10×tbuffer，25℃过夜消化。转化参照sk9302超级感受态细胞试剂盒使用说明书(超级感受态细胞制备试剂盒购于生工生物工程(上海)股份有限公司)，将获得的突变酶表达载体由苏州金唯智生物有限公司测序确认碱基序列。将测序正确的重组质粒pet28a(+)-pveh1^{l105i/m160a/m175i/s178t/v106i/p184w}转化至大肠杆菌e.colibl21感受态细胞中，获得e.colibl21-pveh1z4x4-59重组菌。

实施例2突变酶pveh1z4x4-59的诱导表达

将e.colibl21-pveh1z4x4-59单菌落接种于2ml含100μg/ml卡那霉素的lb培养基中，于37℃、220r/min培养过夜；取2ml培养液转接于100ml含卡那霉素的lb培养基中，培养至od600为0.6-0.8时，加100uliptg(终浓度0.5mmol/l)，20℃诱导10h后离心收集菌体，每g湿菌体用10ml磷酸钠缓冲液(na2hpo4-nah2po4,100mmol/l,ph7.0)悬浮得到菌悬液。

实施例3对映选择性和对映归一性测定

称取50mg重组菌湿菌体悬浮于1ml磷酸钠缓冲液(100mmol·l^-1，ph＝7.0)中，吸取950μl菌悬液(50mg·ml^-1)加入到2mlep管中，25℃孵育5min后加入50μlrac-pcso或rac-mcso(200mmol·l^-1，溶剂为甲醇)至终浓度为10mmol·l^-1，25℃、800r·min^-1恒温震荡反应器中反应10min，取100μl样品用1ml乙酸乙酯萃取，有机相经无水硫酸镁干燥。样品分析采用高效液相色谱仪waterse2695、手性液相色谱柱和紫外检测器。rac-pcso高效液相色谱条件为：流动相为正己烷:异丙醇＝80:20，柱温为30℃，流速为0.8ml·min^-1，检测波长为220nm，手性液相色谱柱as-h(250mm×4.6mm×5μm)。(r)-对氯环氧苯基乙烷((r)-pcso)：6.290min，(s)-p对氯环氧苯基乙烷((s)-pcso)：7.062min，(r)-对氯苯基乙二醇((r)-pcped)：7.977min，(s)-对氯苯基乙二醇((s)-pcped)：9.059min。

rac-mcso高效液相色谱条件为：流动相为正己烷:异丙醇＝90:10，柱温为30℃，流速为0.8ml·min^-1，检测波长为220nm，手性液相色谱柱od-h(250mm×4.6mm×5μm)。(r)-间氯环氧苯基乙烷((r)-mcso)：5.674min，(s)-p间氯环氧苯基乙烷((s)-mcso)：5.786min，(r)-间氯苯基乙二醇((r)-mcped)：9.766min，(s)-间氯苯基乙二醇((s)-mcped)：10.972min底物ees和产物eep的计算公式(2)和(3)所示，其中rs和ss分别代表(r)-pcso或(r)-mcso和(s)-pcso或(s)-mcso的峰面积，rp和sp表示(r)-pcped或(r)-mcped和(s)-pcped或(s)-mcped的峰面积^[17]。酶的对映选择性通常用对映体比率(enantiomericratio,e)来评价，e值越高，则对映选择性越高，其计算公式如(4)，其中c是转化率。

实施例4：突变前后酶的对rac-pcso对映选择性比较

本发明比较了突变前后酶的立体选择性，立体选择性又包括对映选择性与对映归一性两种性质。其中野生酶是指phaseolusvulgaris来源的pveh1，genbank登录号为：xp_007147002.1。

每10mg湿菌体用1ml磷酸钠缓冲液(ph＝7.0，100mmol·l^-1)悬浮，取950ul加入到2mlep管中，加入50μl200mmol·l^-1rac-pcso(溶剂为甲醇)，底物终浓为10mmol·l^-1。放置于25℃、220r·min^-1摇床反应，分别于10、20、30、40、60min、取100μl样品用乙酸乙酯萃取三次(总量为1ml)，并用无水硫酸镁干燥后利用高效液相色谱对样品进行分析。如图3所示，反应40min时，ees达100％。与野生型相比，pveh1z4x4-59对外消旋对氯环氧苯乙烷rac-pcso的e值从2.2提高至26.5。

表1不同突变体对pcso的催化参数

实施例5：突变前后酶的对rac-mcso对映归一性比较

每10mg湿菌体用1ml磷酸钠缓冲液(ph＝7.0，100mmol·l^-1)悬浮，取950ul加入到2mlep管中，加入50μl200mmol·l^-1间氯环氧苯乙烷rac-mcso(溶剂为甲醇)，底物终浓为10mmol·l^-1。放置于25℃、220r·min^-1摇床反应，过夜反应取50μl样品用乙酸乙酯萃取三次(总量为1ml)，并用无水硫酸镁干燥后利用高效液相色谱对样品进行分析。结果发现，经过12h反应后，pveh1z4x4-59对外消旋间氯环氧苯乙烷rac-mcso最终eep从3.1％提高到92.3％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

sequencelisting

<110>江南大学

<120>一种立体选择性提高的菜豆环氧化物水解酶突变体

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pheprogluleutrptyrsertrparghisglnileleualaleuser

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alaleuglytyrargalavalalaproaspleuargglytyrglyasp

505560

thraspalaproalaservalsersertyrthrileleuhisleuval

65707580

alaaspvalvalalaleuileaspserleuglyvalaspglnvalphe

859095

leuvalalahisasptrpglyalaileileglytrptyrthrcysleu

100105110

pheargproaspargilelysalatyrvalcysleuservalprophe

115120125

metproargasnprolysvallysprovalaspalametargalaleu

130135140

tyrglyaspasptyrtyrilecysargpheglngluproglylysala

145150155160

gluthrleutyraspasnasnilegluglualailelysasnileleu

165170175

thrthrargargproglyprotrpileleuprolysgluglyalagly

180185190

serasnproleualaserglyserleuproserargproleuproser

195200205

trpleuserglngluaspleuthrtyrtyralaserlyspheglylys

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thrglyleuthrglyglyleuasntyrtyrargasnleuasnleuasn

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trpgluleuthralaalatrpthrglyvalglnvallysvalproval

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lysasptyrilegluserglyalaphelysargaspvalpropheleu

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gattggggagcaataatcggatggtacacatgtttatttcgacctgatagaatcaaggcc360

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ccaggaccatggatactccccaaagaaggagcgggttccaatccccttgcttcagggtcc600

cttccatcaaggcctcttccatcttggctctcacaggaagatctgacttactatgcttct660

aaatttggcaagacgggcttaactggtggcctcaactactatagaaatctcaacctcaat720

tgggagctcacagcagcatggactggagttcaagtcaaagttcctgtgaagttcattaca780

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