靶向型杀蚊毒素的制作方法

背景技术：

本申请要求于2017年4月4日提交的标题为“靶向型杀蚊毒素”的美国临时专利申请no.62/481,199的优先权，其全部内容通过援引加入合并于此。

本发明涉及靶向型杀蚊毒素和经改造以产生杀蚊毒素从而控制蚊种群的植物。

蚊是被最普遍不喜欢的害虫之一。除了它们常见的令人讨厌的因素，它们还是许多致命和破坏性疾病的携带者。蚊传播的疾病每年在全球造成数百万人死亡，特别是在发展中国家。疫苗仅在一定比例的病毒性疾病中开发成功。每隔十年，新病原体的出现都会加剧这些困难，例如当前的寨卡病和基孔肯雅病的威胁。

控制蚊种群的努力包括旨在去除死水的局域性努力，以及总体而广泛的杀虫剂喷洒。这些努力并未显示出巨大的成功，并且在喷洒杀虫剂的情况下，对非靶标物种产生了负面影响。杀虫剂计划一直是美国控蚊的主要手段，但杀虫剂可能会带来生态后果，如2016年在南卡罗来纳州响应于寨卡病毒威胁进行的杀虫剂处理所导致的大规模蜜蜂杀伤中所见。驱蚊剂在有限的情况下有效，但是，对于日常生活(尤其是家庭)而言，可能无法遵循每天使用驱蚊剂的原则。即使采用现有的蚊虫控制措施，美国的许多公民还是在夏天只是呆在室内，以避免疾病传播的风险以及蚊的烦扰。

技术实现要素：

本发明涉及对蚊有毒但对非靶标昆虫种类无毒的靶向型杀虫蛋白。本发明还涉及经改造以产生毒素的植物。在具体的实施方案中，所述转基因植物表达杀虫毒素蛋白，其包含靶向肽以确保对蚊的特异性。杀虫毒素可以在植物生成的花蜜中产生。这些植物代表了一种生态敏感，具有成本效益且长期的方法，该方法利用了蚊的种群对花蜜摄食的关键性要求。

蚊种群严重依赖花蜜作为食物来源。雄性使用花蜜和其他糖源作为唯一的营养来源，而雌性则依靠它来为其寻血飞行提供能量，从而为越冬和其他目的做准备。利用这一事实，已证明掺有杀虫剂的糖饵是控蚊的可行措施。但是，最好避免完全使用杀虫剂。适当的且有效的杀蚊肽递送机制将使生物安全控蚊策略成为可能。

已经制备了针对特定生物体的毒性肽。使用靶向肽已经改变了抗微生物肽的特异性，并且已经在大肠杆菌中以高产率产生了融合体。已经产生了对金黄色葡萄球菌和变形链球菌具有特异性毒性的化学合成融合肽。此外，显示出表达靶向型融合肽的转基因植物对镰刀菌根腐真菌和蚜虫具有特异性抗性。

本发明内容涉及具有融合在一起的对蚊特异的靶向肽和毒素肽的靶向型融合肽。该靶向肽确保融合肽仅被蚊以某种诱导毒素毒性的方式吸食或结合。除非以这种方式吸食或结合所述融合肽，否则该毒素肽将没有毒性。因此，将所述的肽靶向蚊会产生对非蚊昆虫无作用的毒素。靶向型融合肽可以在包括酵母或大肠杆菌的任何合适的生物体中表达，然后被提取、分离或纯化，以用作杀蚊毒素。

在一些实施方案中，将植物改造成以确保蚊子吸食、消耗、暴露于或以其他方式摄取该肽的方式来生产所述靶向型融合肽。在一些实施方案中，改造花蜜植物以在花蜜中表达所述的靶向型融合肽。花蜜是蚊子生命周期的重要组成部分，对它们非常有吸引力。雄性蚊子依靠花蜜或提供的糖源来维持生存，而雌性蚊子则需要花蜜来驱动他们的寻血飞行。非花蜜植物也可以被改造以表达靶向型融合肽，条件是它以允许蚊消耗或吸食所述肽毒素的方式表达。

本发明还涉及产生靶向融合肽的转基因杀蚊植物。在一些优选的实施方案中，所述植物是花蜜植物，但是它们可以是任何合适的植物，包括树木和灌木。可以被改造为转基因杀蚊植物的优选花蜜植物包括常见的园林凤仙花(gardenimpatiens)植物，该植物在整个潮湿的热带地区都不需要维护就可以生长，而且还是世界上最畅销的商业化铺垫植物。研究表明，凤仙花(尤其是非洲凤仙花(impatienswalleriana))在吸引蚊子、花蜜蛋白产量和被基因转化的能力方面表现优异。在优选的实施方案中，凤仙花植物被改造成仅在花蜜中表达毒素，该毒素对蜜蜂无毒，但在室外园林试验中有效控制蚊子。这些转基因植物是安全性的榜样，因为它们是非农作物植物，特异于一种害虫种类，并且可以被改造为没有能力将毒素转基因传播到周围的生态系统。

在优选的实施方案中，将外源遗传构建体用于表达靶向型毒素肽以进行分离和纯化，或将植物转化为转基因杀蚊植物。该构建体优选地包括不同的方面。利用植物特异性启动子，例如凤仙花蜜启动子。从所述构建体表达杀虫毒素肽。还表达了将与毒素肽形成肽融合体的靶向肽，优选地通过特异性结合例如与消化道上皮的结合来靶向蚊。靶向型毒素对具有抗蚊毒性，但对非靶标昆虫种类无毒。这些特征实现了毒素肽的杀蚊方面。杀蚊的花蜜植物价格便宜，高度可扩大化，在生态上安全，几乎不需要维护。这项技术能够在数十年中为非常大的区域同时提供蚊虫控制。

附图说明

图1显示了用于通过大肠杆菌表达非靶向型增强绿色荧光蛋白(egfp)的构建体。

图2显示了用于通过大肠杆菌表达靶向伊蚊的egfp的构建体。

图3示出了使用靶向型和非靶向型egfp在埃及伊蚊中的荧光测定的结果。

图4显示了用于通过大肠杆菌表达非靶向型hv1a杀虫毒素的构建体。

图5显示了用于通过大肠杆菌表达靶向伊蚊的hv1a杀虫毒素的构建体。

图6显示口服给予靶向型毒素和非靶向型毒素后埃及伊蚊存活曲线的比较。

图7显示了使用靶向伊蚊的egfp和非靶向型egfp在致倦库蚊(culexquinquefasciatus)中进行荧光测定结果。

图8显示口服给予靶向伊蚊的毒素和非靶向型毒素后致倦库蚊存活曲线的比较。

具体实施方式的详细描述

本发明涉及靶向型毒素肽，其对蚊有毒而对其他非靶标物种无毒。本发明还涉及表达编码蚊特异性毒素的外源基因的杀蚊植物。

在优选的实施方案中，本发明涉及靶向蚊的毒素。所述毒素是由与毒素结构域融合的靶向型结构域组成的融合毒素肽。所述靶向肽产生与蚊的特异性结合，例如通过使所述融合毒素肽以诱导毒性的方式结合蚊。在优选的实施方案中，所述靶向肽特异性地靶向蚊的属或种。有三个具体的蚊的种与疾病传播最相关：埃及伊蚊(aedesaegypti)，其携带黄热病、寨卡病毒、基孔肯雅热、登革热和脑炎；冈比亚按蚊(anophelesgambiae)，其携带疟疾；以及库蚊(culex)属的各个种，其携带西尼罗河病毒、脑炎和丝虫病。在一个优选的实施方案中，所述靶向肽被设计成靶向埃及伊蚊。登革病毒糖蛋白的结构域iii已显示为活性结构，可使登革病毒颗粒与蚊子消化道上皮细胞结合，从而使病毒成功进入所述细胞内(hrobowski(2005)virologyjournal2:49)。在一个优选的实施方案中，来自登革病毒糖蛋白的结构域iii的肽用于将杀虫肽靶向埃及伊蚊的消化道。使用这种靶向蛋白将融合的毒素肽特异地针对蚊子的消化道将会导致毒素对蚊子是致死的，但而不会影响蜜蜂和其他授粉媒介。

在进一步的优选实施方案中，所述靶向肽具有以下序列：migvepgqlklnwfkk(seqidno:1)。

在另外的优选实施方案中，所述靶向型结构域可以源自寨卡(zika)病毒或西尼罗(westnile)病毒的结构域iii的序列。可以将所述靶向型结构域设计为靶向除伊蚊之外的其他种类的蚊子，例如库蚊属的多个种。合适的靶向型结构域与登革病毒糖蛋白的结构域iii的作用相似，因为它们允许其所来源的病毒与蚊子特异性结合。可以使用任何合适的靶向肽，只要它(1)可以在植物中表达，(2)促进与靶蚊在会诱发毒性的部位(例如消化道)的特异性结合，而不与任何非靶标物种特异性结合，以及(3)能够与选择的肽毒素形成融合肽。登革病毒，寨卡病毒和西尼罗病毒都是黄病毒，并且来自这些病毒中每种病毒的结构域iii的序列在本发明中应可作为靶向肽而有效地发挥作用。

在杀蚊植物的进一步优选的实施方案中，选择在结合到消化道后对蚊有毒的毒素。值得注意的是，没有必要使用对其他昆虫物种完全没有毒性的毒素。即使该肽被其他昆虫从凤仙花蜜中吸收，与毒素结合的靶向肽也可确保该毒素仅特异性地影响蚊。在优选的实施方案中，所述毒素肽是hv1a蜘蛛毒素肽。该毒素肽已被成功地靶向蚜虫。

在进一步优选的实施方案中，所述毒素肽具有以下序列：sptcipsgqpcpynenccsqsctfkenengntvkrcd(seqidno:2)。

另外的优选实施方案利用融合肽中的其他毒素，包括天然存在于花蜜中的抗微生物肽，其可以转化为对蚊子具有毒性。可以使用任何合适的毒素肽，只要它(1)可以在植物中表达，(2)对蚊有毒，并且(3)能够与所选的靶向肽形成融合肽。实例包括毒素cry11b或来自苏云金芽孢杆菌的任何杀蚊cry毒素。这些尤其对蚊幼虫具有高毒性。其他合适的毒素包括抗微生物肽laterosporulin(一种来自短杆菌属的细菌素)和花蜱(amblyomma)防御素肽-2(希伯来花蜱(abralyommahebraeum)的一种防御素)。两者在转基因烟草植物中均良好表达。

在另外的实施方案中，所述融合毒素肽由通过适宜接头连接到适宜毒素肽的适宜靶向肽组成。在另外的优选实施方案中，seqidno：1的靶向肽和seqidno：2的毒素肽通过具有序列ggsgggsgg(seqidno：3)的接头连接。

优选的实施方案涉及所述融合毒素肽本身和产生融合毒素肽的方法，例如通过在大肠杆菌或酵母中表达，然后将肽提取，分离或纯化为可作为杀蚊毒素使用的形式。所述融合毒素肽可以与任何合适的载体，例如糖或花蜜样物质结合，以产生可能被蚊吸食或消耗的杀蚊物质。由于融合毒素肽对蚊的靶向特异性，该物质对非靶标物种无毒。

进一步的优选实施方案涉及转基因杀蚊植物，其被改造成以如下方式来表达所述的融合毒素肽：使得该肽可被蚊子吸食或消耗，或者使该肽暴露于蚊子以被摄取。在一些优选的实施方案中，由于花蜜对蚊子具有强烈的自然吸引力，所以转基因杀蚊植物是花蜜植物。

杀蚊花蜜植物的优选实施方案利用最常见的园林凤仙花种类，即非洲凤仙花(impatienswalleriana)，其来自东非。凤仙花是世界上最常见的花坛植物。它们价格便宜，易于生长且需要很少的维护。最近的一项生态研究表明，凤仙花可以在整个潮湿热带地区以及大部分潮湿温带地区生长而无需维持(野生)，这与伊蚊(aedes)和按蚊(anopheles)蚊媒种类的区域非常接近。具体而言，凤仙花的适应范围包括美国东部所有地区，拉丁美洲大部分地区，东南亚，中国，印度，欧洲和非洲大部分地区。在无霜地区，其为定植。在霜冻地区，每年春季种植一次。

此外，非洲凤仙花(impatienswalleriana)对蚊极具吸引力，并且本领域技术人员可以毫无困难地对其进行基因改造。非洲凤仙花的基因组已经测序。已经组装了驱动最高表达的花蜜蛋白(叶绿素类似物)的表达的启动子(3kbdna)，并在优选的实施方案中用于驱动在非洲凤仙花中靶向蚊的毒素肽的表达。可以从基因组测序中分离与天然凤仙花抗微生物肽和杀虫肽相对应的基因。在另外的优选实施方案中，可以通过使用含有最少的外来dna和几乎完全天然的凤仙花dna的基因插入盒将它们靶向蚊。

转基因杀蚊植物被独特地定位为转基因生物安全作用模型。该技术具有多种特性，可促进epa和公众的接受。首先，该技术是可逆的。与基因驱动方案不同，总是有可能通过将植物连根拔起来逆转对蚊的控制。例如，凤仙花不产生持久的根茎或块茎。而且，该技术是局域化的且可预测的。控制区域取决于人类在何处种植植物。另外，一些优选的植物，例如凤仙花，可以通过插条或种子商业化生产。因此，种子和花粉毒素基因切除技术(防止转基因逃逸到生态系统)不会干扰商业生产。而且，预期对非靶标蜜蜂或其他非靶标昆虫没有毒性作用。其也是医疗用途，而不是食品。与转基因作物不同，这些植物不会成为人类食物链的一部分。该应用也由终端用户购买和安装。与远程农场生产的食品不同，所述的解决方案中终端用户对技术具有所有权，从而促进了认可度。最后，尤其是园林植物是住宅生活的传统和既定组成部分。本发明的技术使得对蚊的控制成为“景观的一部分”。

因此，本发明的优选实施方案包括一种用于生产表达杀蚊毒素的修饰植物的方法，包括在植物的花蜜中表达杀蚊毒素的杀蚊花蜜植物。该方法包括在植物的细胞中诱导编码融合毒素肽的外源基因构建体的表达，使得该融合毒素肽实际上存在于植物中并被固有地表达。融合毒素肽包括与毒素肽融合的蚊靶向肽，并且对蚊子具有特异性毒性。在另外的优选实施方案中，所述植物是非洲凤仙花(impatienswalleriana)。在另外的优选实施方案中，靶向蚊子的肽靶向伊蚊，按蚊或库蚊的一种或多种。在另外的优选实施方案中，所述蚊靶向肽例如通过结合埃及伊蚊的消化道上皮而靶向埃及伊蚊(aedesaegypti)。在另外的优选实施方案中，所述的毒素肽是具有对蚊子具有毒性的肽，并且可以优选是hv1a蜘蛛毒素肽。在进一步优选的实施方案中，所述融合毒素肽对其他生物没有毒性。

本发明的优选实施方案利用外源基因构建体，其包括对植物特异的启动子，编码蚊子靶向肽的基因和编码毒素肽的基因。在另外的优选实施方案中，通过如下方法在植物中诱导外源基因构建体的表达：用外源基因构建体转化植物的至少一个花蜜产生细胞，以产生在植物的花蜜中表达融合毒素肽的修饰植物。

另外的优选实施方式涉及产生在花蜜以外的组织中不表达毒素的修饰植物。在这些优选的实施方案中，在所述修饰的植物中还诱导了终止子盒的表达，并且所述终止子盒从核酸中切除在除产生花蜜的细胞以外的细胞中发现的外源基因构建体，所述除产生花蜜的细胞以外的细胞诸如种子，花粉，根，和叶子的细胞。因此，修饰的植物在其花蜜中表达融合毒素肽，而在非花蜜组织中不表达融合毒素肽。

本发明的其他优选实施方案包括修饰的杀蚊植物，其中所述修饰的植物以使所述融合毒素肽可被蚊消耗、暴露、或一般性摄取的方式在所述植物的细胞中表达编码融合毒素肽的外源基因构建体，其中所述融合毒素肽包含与毒素肽融合的蚊子靶向肽，并且其中所述融合毒素肽对蚊有毒。在进一步优选的实施方案中，所述植物是产生花蜜的植物，并且所述融合毒素肽在所述植物的花蜜中表达。在其他优选的实施方案中，所述修饰的植物是非洲凤仙花。所述修饰植物的另外的优选实施方案将蚊靶向肽表达为靶向伊蚊，按蚊或库蚊，或者优选地靶向埃及伊蚊的融合毒素肽的一部分。所述蚊子靶向肽可优选结合埃及伊蚊的消化道上皮。通常，在优选的实施方案中，所述毒素肽是具有对蚊子毒性的肽，并且优选地，所述毒素肽是hv1a蜘蛛毒素肽。在另外的优选实施方案中，由修饰的杀蚊植物表达的融合毒素肽对其他生物没有毒性。

另外的优选实施方式包括修饰的杀蚊植物的种子。

本发明的进一步优选的实施方案包括修饰的杀蚊的非洲凤仙花植物，其中所述修饰的植物(a)在产生花蜜的植物的细胞中表达编码融合毒素肽的外源基因构建体，其中所述融合毒素肽包含与毒素肽融合的蚊靶向肽，其中该蚊子靶向肽与埃及伊蚊的消化道上皮结合，其中所述毒素肽是hv1a蜘蛛毒素肽，和(b)终止子盒，其中所述终止子盒从核酸中切除在除产生花蜜的细胞以外的植物细胞中发现的外源基因构建体，其中所述修饰的植物不能在该修饰的植物的非花蜜组织中表达所述融合毒素肽。

实施例1

在先前的研究中，调查了37种植物对蚊的吸引力，花蜜蛋白输出和被基因转化的能力。在这些候选植物中，常见园林凤仙花植物(impatienswalleriana)在所有领域都表现出色(chenandkearney，actatropica(2015)146：1-88)。因此，检测了花蜜和蜜腺器官的蛋白质组和转录组，并鉴定了在花蜜中产生的主要蛋白质。克隆了凤仙花基因组的相应基因，并鉴定了用于在花蜜中表达肽毒素的相应启动子。拟南芥的蜜腺启动子也用于创建在花蜜中表达标记基因的转基因凤仙花植物。gus标记基因使用拟南芥的蜜腺特异性启动子在凤仙花中表达，表明这些植物可以作为外源蛋白质的花蜜递送载体。已经分析了凤仙花的花蜜转录组，叶和茎控制转录组。

对非洲凤仙花基因组的测序和分析有助于凤仙花花蜜启动子的分离。已经获得了来自花蜜，茎和叶组织的rna-seq数据，以及来自花蜜蛋白的质谱数据。鉴定并克隆了高度表达的花蜜蛋白的启动子。测定这些启动子在转基因凤仙花中rfp荧光标记物的花蜜表达。

测试了不同的靶向肽与蚊消化道上皮包括埃及伊蚊消化道上皮的简单结合。鉴定的靶肽是来自登革病毒糖蛋白的结构域iii的肽。在大肠杆菌中产生靶向肽/egfp融合蛋白，并将融合蛋白悬浮在5％蔗糖中以便被吸食。喂食后，通过荧光显微镜检查蚊虫的消化道。延长或缩短靶向肽序列以优化结合。最佳结合的靶向肽用于产生靶向肽/杀虫肽融合物，包括靶向肽/hv1a杀虫肽融合物。这些融合肽在大肠杆菌中表达，纯化并喂给蚊子以确定埃及伊蚊的死亡率。对非靶标生物(例如果蝇)进行了类似的测试，以证明没有非靶标毒性。

已经表明表达靶向融合肽的转基因植物对镰刀菌根腐真菌(fusariumrootrotfungus)和蚜虫具有特异性抗性。在bonning等人(2014)naturebiotechnology32(1)：102中，将hv1a蜘蛛毒素肽融合到植物黄体病毒的外壳蛋白上。该病毒通过其外壳蛋白自然地将自身与蚜虫的口器(stylet)结合，从而在蚜虫体内跟随其到达不同的植物。hv1a肽不会因被吸食而对蚜虫产生毒性，但是，当与变黄病毒(luteovirus)外壳蛋白融合时，它具有很强的毒性，并且仅对蚜虫具有特异性，对其他昆虫没有毒性。

最强的花蜜启动子用于测试多种杀虫肽在凤仙花蜜中的表达潜力。融合了最佳消化道靶向序列和杀虫序列的基因在大肠杆菌中表达，并通过吸食针对蚊进行测试。最好的融合构建体被置于凤仙花中。从凤仙花组织培养中繁殖出的多个芽簇中繁殖所得的幼苗，以建立用于田间试验的苗种。进行了非靶标道德测定，包括针对蜜蜂，草蛉，瓢虫和蝴蝶的一个种的测定，以证明缺乏非靶标毒性。

使用室外中观实验进行现场测试。在住宅区的8'x10'网眼笼子内，配置了混合物种测试花园，其中包含混合有竞争性园林植物的几种杀蚊花蜜凤仙花。引入蚊并记录死亡率。

实施例2

本实施例举例说明了通过使用来自登革病毒糖蛋白的结构域iii序列的肽靶向埃及伊蚊。该序列使登革病毒与蚊消化道壁结合并开始蚊的感染过程。该糖蛋白的活性部分与egfp荧光蛋白融合，融合蛋白(包括稳定蛋白sumo)在大肠杆菌中表达。然后将纯化的蛋白质添加到10％蔗糖中，并以脉冲追踪的方式喂入蚊，以确保在消化道中观察到的任何荧光确实是由于与消化道壁的稳定结合所致。

使用来自lifesensors(malvern，pa)的pe-sumostar载体在感受态大肠杆菌bl21(de3)和来自neb(newenglandbiolabs，ipswich，ma)的大肠杆菌10-beta中进行大肠杆菌表达。从idt(skokie，il)获得了针对大肠杆菌表达进行了优化的gblocks密码子，其中包含egfp，登革/egfp融合蛋白，毒素hv1a和登革/hv1a融合序列。所有埃及伊蚊蚊卵和致倦库蚊(culexquinquefasciatus)幼虫均购自benzonresearchinc.(carlisle,pa)。

构建了两个在其他方面相同的构建体以在大肠杆菌中表达以下标记：

1.egfp标记

2.靶向egfp标记

这些构建体中的每一个都是sumo载体，其包含与有效载荷肽融合的sumo稳定蛋白，如图1和图2所示。表达由lac操纵子，t7启动子和t7终止子控制。6xhis标签可用于下游纯化。kanr和laci被包括用于克隆选择。黄病毒e蛋白结构域iii环(seqidno：1)用于将融合蛋白靶向埃及伊蚊的消化道壁。egfp是荧光标记蛋白基因。sumo载体可商购，egfp是标准标记蛋白。

构建用于egfp、登革/egfp融合、毒素hv1a和登革/hv1a融合序列的gblock。登革靶向结构域取自登革病毒e糖蛋白结构域iii的最后45bp。用序列特异性引物扩增合成的gblock序列，所述引物设计为分别侧接具有mfei和bamhi的限制性酶切位点的序列，所述扩增使用高保真dna聚合酶(neb，pcrusing…(2018年))。这些pcr扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，并使用promegasv凝胶和pcrclean-upsystem(promega，madison，wi(2018))进行凝胶纯化。将纯化的pcr产物和pe-sumostar载体用限制酶mfei和bamhi于37℃消化1小时。然后将这些消化的产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，并用promegasv凝胶和pcr清洁系统进行凝胶纯化。使用nebt4dna连接酶将消化的pcr产物连接到消化的pe-sumostar载体中(neb，ligationprotocol…(2018))。将这些重组质粒电穿孔到neb10-β感受态大肠杆菌中，然后将转化的菌落在含有lb和50μg/ml卡那霉素的琼脂平板上于37℃选择性生长过夜。使用nebtaq聚合酶用前述引物确认阳性转化菌落，将其接种到10ml含50ug/ml卡那霉素的lb中，并在37℃摇床中过夜生长(neb，pcr协议…(2018年))。使用promegaplussvminiprepsdna纯化系统从lb培养物中纯化阳性重组质粒，并将其转化为具有化学感受态nebbl21大肠杆菌(promega，plus…(2018))。

将阳性bl21转化体在37℃摇床上在含有50μg/ml卡那霉素的20ml2xyt肉汤中生长过夜。用20ml原代培养物接种500ml含50μg/ml卡那霉素的2xyt传代培养物，并在37℃摇动(220rpm)至od600为0.7。用0.1mmiptg在培养物中诱导蛋白质表达并在4℃振摇过夜(180rpm)。收获细胞，在4℃以8,000xg离心1小时。将细胞重悬于1xpbs中，并在-20℃用0.1mg/ml溶菌酶裂解过夜。将溶解的悬浮液解冻并用探针超声仪以40％的振幅超声处理。将超声处理的浆液在4℃以80,000xg离心1小时。收集上清液，并通过镍柱色谱法纯化，使用1xpbs作为结合和洗涤缓冲液，并使用含有500mm咪唑的1xpbs作为洗脱缓冲液。将纯化的蛋白在1xpbs中于4℃透析过夜，以除去咪唑。将纯化的蛋白质与1mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml，0.1mg/ml和0.05mg/mlbsa一起在18％sds-page凝胶上电泳以确认其存在并使用imagej(schneider(2012))测定其浓度。

在装有1升自来水和碎鱼食(tetra，blacksburg，va)的塑料托盘中饲养埃及伊蚊卵。到达后将库蚊(c.quinquefasciatus)幼虫转移到塑料托盘中，并给其切碎的鱼食补充肝粉。将所有群体维持在27±1℃，70±5％rh。蚊达到蛹期后，将它们转移到塑料管中，以帮助成年后进行性别鉴定。

每种egfp肽用于制备10％的蔗糖溶液。使用1xpbs制成10％的蔗糖溶液，制成缓冲液阴性对照。将每种荧光蛋白和对照蔗糖溶液添加到4ml容器内部的棉球中，并将每个容器放入单独的透明蚊测定室中。将10只雄性和10只雌性埃及伊蚊和库蚊的成虫蚊转移到每个小室中，并储存在27±1℃，70±5％rh。2天后，将所述蚊转移到仅包含10％蔗糖的小室中。再过两天后，收获中肠。在带有荧光单元和gfp滤光片的立体显微镜szx16下观察荧光(激发：460-495nm，发射：510nm+)。所有脉冲追踪实验均作为三个独立的重复进行。

图3显示，对于雄性(左)和雌性(右)蚊，egfp已成功地靶向埃及伊蚊的消化道壁。图3最下面的图显示，在给蚊“脉冲”喂食含靶标egfp的10％蔗糖2天后，接着是2天“追逐”喂食单独的10％蔗糖，登革肽靶向型egfp仍然保持附着在消化道壁上。图3中间的小图显示在阴性对照实验中，在追加10％蔗糖后，非靶向的egfp没有保留在消化道中。在图3最上方的图中显示空对照实验中，在连续喂食悬浮在pbs缓冲液中的10％蔗糖的情况下没有荧光。

实施例3

本实施例举例说明了使用来自特异于特定蚊的种的病毒的宿主结合蛋白来靶向该蚊种。结果表明通过使用来自登革病毒糖蛋白的结构域iii的序列的肽可靶向杀死埃及伊蚊。具体来说，hv1a杀虫毒素针对埃及伊蚊的弱天然毒性通过将其与登革来源的靶向肽融合而大大增强。

在本实施例中，构建了两个构建体以在大肠杆菌中表达如下毒素，所述构建体在其他方面与前文中在实施例2中使用的两个构建体相同：

1.hv1a毒素

2.靶向hv1a毒素

图4和图5中所示的这些构建体中的每一种，都是含有与有效负载肽融合的sumo稳定蛋白的sumo载体。表达由lac操纵子，t7启动子和t7终止子控制。6xhis标签可用于下游纯化。存在kanr和laci用于克隆选择。包括黄病毒e蛋白结构域iii环(seqidno：1)，用于将融合蛋白靶向埃及伊蚊的消化道壁。“毒素”是指hv1a毒素基因(seqidno：2)。

将每种毒素稀释至500μg/ml，并用于制备10％的蔗糖溶液。再次使用1xpbs制备缓冲液阴性对照10％蔗糖溶液。如上所述，将每种毒素和对照蔗糖溶液添加到蚊测定室中。将10只雄性和10只雌性埃及伊蚊和库蚊的成虫蚊转移到每个小室中，并储存在27±1℃，70±5％rh。允许蚊吸食10％的蔗糖，其中含有hv1a毒素或无添加的蛋白质(“缓冲液”)，其中所述hv1a毒素融合于靶向伊蚊的登革来源的肽。每24小时记录一次死亡事件，持续3天。为该实验进行了3次重复。graphpadprism7用于使用log-rank(mantel-cox)测试分析记录的数据的显著性，并以具有95％置信区间(ci)的生存曲线表示所述数据。

针对埃及伊蚊靶蚊的靶向毒素实验的结果示于图6。单独喂食10％蔗糖(“缓冲液”)的蚊没有死亡，在仅喂食含毒素的10％蔗糖的蚊种群中观察到少量毒性。相反，用包含来自登革病毒的靶向肽的伊蚊靶向毒素记录到大大增强的毒性。条形表示95％置信度限制。

实施例4

本实施例举例说明了本文所述靶向机制的极高特异性。结果表明，当被非登革病毒宿主的致倦库蚊(culexquinquefasciatus)吸食时，靶向毒素的毒性不超过非靶向毒素。换句话说，靶向肽不能增强基础毒素的最小毒性。

如实施例3中所述，使用相同的构建体，并且使成年库蚊吸食含有hv1a毒素的10％蔗糖或不添加蛋白(“缓冲液”)，所述hv1a毒素融合至登革病毒来源的靶向伊蚊的肽。荧光研究的结果显示在图7中。针对伊蚊的egfp都不会与致倦库蚊的消化道壁结合，无论其是雄性蚊还是雌性蚊。图7最下方的图显示在2天“脉冲”饲喂含靶向egfp的10％蔗糖然后2天“追逐”饲喂单独的10％蔗糖后，在消化道壁中未观察到登革肽靶向的egfp。图7中间的图显示在阴性对照实验中，在用10％蔗糖追逐喂食后，非靶向egfp没有保留在消化道中。图7最上面的图表明，在空对照实验中，用悬浮在pbs缓冲液中的10％蔗糖连续喂食未观察到荧光。

图8显示用靶向伊蚊的杀虫肽喂养的致倦库蚊(culexquinquefasciatus)非靶标蚊的存活百分率的结果。每天进行死亡率计数。用仅10％蔗糖的库蚊(“缓冲液”)，含毒素的10％蔗糖的库蚊(“毒素”)或含有来自登革病毒的靶向肽的伊蚊靶向型毒素喂食的库蚊(“登革/毒素”)之间没有显着差异。条形表示95％置信度限制。

这证明了靶向机制是极其特异性的，甚至在属的水平上也是如此。预计对蜜蜂和其他无关传粉媒介的无毒性的严格测试将产生相同的结果，因为这种更严格的测试甚至在不同类型的蚊之间也显示出特异性。

对比文件

以下公开文献在此援引加入本文作为参考:

bonningetal.(2014)naturebiotechnology32(1):102

hrobowski(2005)virologyjournal2:49

chen&kearney,actatropica(2015)146:1-88

neb.pcrusinghigh-fidelitydnapolymerase(m0491).neb(2018).

promega.svgelandpcrclean-upsystem.promega(2018).

neb.ligationprotocolwitht4dnaligase(m0202).neb(2018).

neb.pcrprotocolfortaqdnapolymerasewithstandardtaqbuffer(m0273).neb(2018).

promega.plussvminiprepsdnapurificationsystem.promega(2018).

schneider,c.a.,rasband,w.s.&eliceiri,k.w.nihimagetoimagej:25yearsofimageanalysis.nat.methods9,671–675(2012).

序列表

<110>贝勒大学

c·m·卡尼

g·普鲁厄特

<120>靶向型杀蚊毒素

<130>208614.00223

<150>us62/481,199

<151>2017-04-04

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>16

<212>prt

<213>登革病毒

<400>1

metileglyvalgluproglyglnleulysleuasntrpphelyslys

151015

<210>2

<211>37

<212>prt

<213>悉尼漏斗网蜘蛛(atraxrobustus)

<400>2

serprothrcysileproserglyglnprocysprotyrasngluasn

151015

cyscysserglnsercysthrphelysgluasngluasnglyasnthr

202530

vallysargcysasp

35

<210>3

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>接头

<400>3

glyglyserglyglyglyserglygly

15

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种杀蚊毒素，包括：

融合毒素肽，其中所述融合毒素肽包含与毒素肽融合的蚊靶向肽，其中所述蚊靶向肽是包含来自登革病毒糖蛋白结构域iii的序列的肽，并且其中所述融合毒素肽具有抗蚊毒性。

2.根据权利要求1所述的杀蚊毒素，其中所述蚊靶向肽靶向伊蚊。

3.根据权利要求1所述的杀蚊毒素，其中所述蚊靶向肽靶向埃及伊蚊。

4.根据权利要求1所述的杀蚊毒素，其中所述蚊靶向肽结合埃及伊蚊的消化道上皮。

5.根据权利要求1所述的杀蚊毒素，其中所述毒素肽是具有抗蚊毒性的肽。

6.根据权利要求1所述的杀蚊毒素，其中所述毒素肽是在不与所述蚊靶向肽融合的情况下没有抗蚊毒性的肽。

7.根据权利要求1所述的杀蚊毒素，其中所述毒素肽是hv1a蜘蛛毒素肽。

8.根据权利要求1所述的杀蚊毒素，其中所述融合毒素肽对其他生物体没有毒性。

9.根据权利要求1所述的杀蚊毒素，其进一步包含载体。

10.一种生产表达杀蚊毒素的修饰植物的方法，包括：

诱导编码融合毒素肽的外源基因构建体在所述植物的靶细胞中表达，其中所述融合毒素肽包含与毒素肽融合的蚊靶向肽，其中所述蚊靶向肽是包含来自登革病毒糖蛋白结构域iii的序列的肽，并且其中所述融合毒素肽具有抗蚊毒性；和

产生表达所述融合毒素肽的修饰植物。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述植物是花蜜植物，所述植物的靶细胞是产花蜜细胞，并且所述修饰植物在该植物的花蜜中表达所述融合毒素肽。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述植物是非洲凤仙花。

13.根据权利要求10所述的方法，其中所述蚊靶向肽靶向伊蚊。

14.根据权利要求10所述的方法，其中所述蚊靶向肽靶向埃及伊蚊。

15.根据权利要求10所述的方法，其中所述蚊靶向肽结合埃及伊蚊的消化道上皮。

16.根据权利要求10所述的方法，其中所述毒素肽是具有抗蚊毒性的肽。

17.根据权利要求10所述的方法，其中所述毒素肽是在不与所述蚊靶向肽融合的情况下没有抗蚊毒性的肽。

18.根据权利要求10所述的方法，其中所述毒素肽是hv1a蜘蛛毒素肽。

19.根据权利要求10所述的方法，其中所述融合毒素肽没有对其他生物体的毒性。

20.根据权利要求10所述的方法，其中所述外源基因构建体包含对所述植物特异的启动子，编码所述蚊靶向肽的基因和编码所述毒素肽的基因。

21.根据权利要求10所述的方法，其中诱导所述外源基因构建体表达的步骤包括用该外源基因构建体转化所述植物的至少一个细胞以产生表达所述融合毒素肽的修饰植物。

22.通过权利要求10的方法制备的修饰植物。

23.一种产生在植物的花蜜中表达杀蚊毒素的修饰植物的方法，包括：

在产花蜜植物细胞中诱导编码融合毒素肽的外源基因构建体的表达，其中所述融合毒素肽包含与毒素肽融合的蚊靶向肽，其中所述蚊靶向肽是包含来自登革病毒糖蛋白结构域iii的序列的肽，其中所述毒素肽是hv1a蜘蛛毒素肽，并且其中所述植物是非洲凤仙花；和

产生修饰植物，所述修饰植物在该修饰植物的花蜜中表达所述融合毒素肽并且在该修饰植物的非花蜜组织中不表达所述融合毒素肽。

24.通过权利要求23的方法产生的修饰植物。

25.一种修饰的杀蚊植物，其中所述修饰植物在所述植物的靶细胞中表达编码融合毒素肽的外源基因构建体，其中所述融合毒素肽包含与毒素肽融合的蚊靶向肽，其中所述蚊靶向肽是包含来自登革病毒糖蛋白结构域iii的序列的肽，并且其中所述融合毒素肽具有抗蚊毒性。

26.根据权利要求25所述的修饰的杀蚊植物，其中所述植物是花蜜植物，所述植物的靶细胞是产花蜜细胞，并且所述修饰的杀蚊植物在所述植物的花蜜中表达所述融合毒素肽。

27.根据权利要求26所述的修饰的杀蚊植物，其中所述植物是非洲凤仙花(impatienswalleriana)。

28.根据权利要求25所述的修饰的杀蚊植物，其中所述蚊靶向肽靶向伊蚊。

29.根据权利要求25所述的修饰的杀蚊植物，其中所述蚊靶向肽靶向埃及伊蚊。

30.根据权利要求25所述的修饰的杀蚊植物，其中所述蚊靶向肽结合埃及伊蚊的消化道上皮。

31.根据权利要求25所述的修饰的杀蚊植物，其中所述毒素肽是具有抗蚊毒性的肽。

32.根据权利要求25所述的修饰的杀蚊植物，其中所述毒素肽是在不与所述蚊靶向肽融合的情况下没有抗蚊毒性的肽。

33.根据权利要求25所述的经修饰的杀蚊植物，其中所述毒素肽是hv1a蜘蛛毒素肽。

34.根据权利要求25所述的修饰的杀蚊植物，其中所述融合毒素肽没有对其他生物体的毒性。

35.根据权利要求25所述的修饰的杀蚊植物，其中所述外源基因构建体包含对所述植物的花蜜具有特异性的启动子，编码所述蚊靶向肽的基因和编码所述毒素肽的基因。

36.根据权利要求25所述的修饰植物的种子。

37.一种修饰的杀蚊非洲凤仙花植物，其中所述修饰植物在产花蜜植物细胞中表达编码融合毒素肽的外源基因构建体，其中所述融合毒素肽包含与毒素肽融合的蚊靶向肽，其中所述蚊靶向肽是包含来自登革病毒糖蛋白结构域iii的序列的肽，其中所述毒素肽是hv1a蜘蛛毒素肽，并且其中所述修饰植物不能在该修饰植物的非花蜜组织中表达所述融合毒素肽。