一种趋氧受体基因aer功能丧失的大肠杆菌菌株及制备方法与流程

本发明属于生物技术工程领域，具体涉及通过大肠杆菌aer基因被敲除而丧失趋氧受体基因，致使该菌丧失对氧气的趋化性功能。

背景技术：

趋化性是细菌调控对外界环境做出适应性反应的感受系统之一，有运动能力的细菌对浓度不同的化学物质做出反应，使之趋向有利的环境，或逃避有害与不利的环境。趋氧性(或者能量趋性)是趋化性的一种，是一种能引导细菌自动定位并移动于某处，从而使它们可以达到最佳胞内氧水平。这种趋氧性是通过呼吸链完成的，由此可见趋氧性传感器对各类细菌的生命活动极为重要。运动型细菌大多具有这种趋氧性，并且趋氧性在细菌的生命周期中具有重要的生物学功能。大肠杆菌中编码趋氧性受体基因是aer。研究细菌的趋化性，构建大肠杆菌趋氧受体基因aer功能丧失模型，对研究控制细菌的侵染过程，治理病害；治理环境污染，净化污水；以及研究治疗癌症等疾病都有重要意义。

技术实现要素：

为了克服现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种趋氧受体基因aer功能丧失的大肠杆菌菌株，利用λ-red重组酶方法，对编码大肠杆菌趋氧性受体基因aer进行敲除，使之丧失趋氧性，构建一个大肠杆菌趋氧受体基因aer功能丧失菌株模型。用于研究细菌的侵染过程，治理病害；为治理环境污染，净化污水提供理论依据。

本发明的另一目的是提供制备上述大肠杆菌菌株的方法。

为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：

第一方面，提供一种趋氧受体基因aer功能丧失的大肠杆菌菌株的制备方法，包括以下步骤：

(1)设计引物：

用于同源重组的引物为aer-tet-r和aer-tet-f；设计原则是5'端为aer基因的同源区(未加下划线)，3'端为四环素抗性基因tetra的同源序列(加下划线)，重组体的检测所用引物为jc-aer-r及jc-aer-f，这些引物的序列如下所示：

aer-tet-r:atcaggcattgtgctccaaccgcccggatccggcataccgactaagcacttgtctcctg；

aer-tet-f:caagaagttaacaaccatataacctgcacaggacgcgaacttaagacccactttcaca；

jc-aer-r:aagatgcgccagcatcgc；

jc-aer-f:ggccgacataaactctga；

(2)含tetra基因的dna片段的扩增：

以含有四环素抗性基因的大肠杆菌dh10bac(tet⁺，kan⁺，购自武汉淼灵生物科技有限公司)的dna为模板，aer-tet-r和aer-tet-f为引物进行pcr扩增，获得两端分别与aer基因上、下游同源，中间为四环素抗性基因tetra的dna片段。将该片段进行琼脂糖凝胶回收，以用于下一步电转化。

(3)感受态细胞的制备：

将含有pkd46质粒的mg1655菌株在含有20μg/mlamp的lb培养基中30℃下过夜培养，之后以1:100的比例接种到含20μg/mlamp的lb中30℃下震荡培养，当od600达到0.6时加入0.2％的阿拉伯糖进行诱导，4小时后4℃下收集细胞，用1/2体积预冷的无菌去离子水洗2次，并浓缩为原体积的1/40，作为感受态细胞备用。

(4)电转及目的菌株的筛选与鉴定

将胶回收的dna片段(100ng)与80μl感受态细胞在电转杯中混合，冰浴5-10min后，用2200v电击，电击后迅速加入1000μllb培养液，30℃下震荡培养30min后在20μg/ml的四环素平板上涂板，37℃下过夜培养，平板上长出的菌落为抗四环素的菌落，对其进一步在四环素平板上划线纯化，并用jc-aer-r及jc-aer-f引物对这些菌落进行菌落pcr鉴定，有四环素抗性基因tetra的dna片段的菌落即为大肠杆菌基因aer敲除的菌株。

获得大肠杆菌趋氧受体基因aer敲除菌株，还可以通过部分敲除aer基因或在aer基因中插入外源dna片段来实现。部分敲除aer基因引物设计原则是先确定要敲除的序列，引物的5'端为待敲除序列相邻的同源区，3'端为四环素抗性基因tetra的同源序列；插入外源dna序列使aer基因失活的引物设计原则是先确定插入外源dna的位置，引物的5'端为待插入位置相邻的同源区，3'端为四环素抗性基因tetra的同源序列。用来敲除、替换或插入的基因片段，出来可以选用四环素抗性基因tetra的dna片段外，还可以选择其它抗性基因片段，如氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、甲氧西林抗性基因、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、链霉素抗性基因等抗性基因；或者其它便于筛选的标记基因如绿色/红色荧光蛋白基因等。

第二方面，提供上述制备方法获得的趋氧受体基因aer功能丧失的大肠杆菌菌株。

本发明相对于现有技术的优势在于：

构建大肠杆菌趋氧受体基因aer功能丧失模型，用于研究细菌的侵染过程，治理病害；为治理环境污染，净化污水提供理论依据。

附图说明

图1pcr产物切胶回收电泳检测；

m：dl2000dna标样；1：四环素抗性基因胶回收产物。

图2菌落pcr鉴定图；

m：dl2000dna标样；1-4：实验组；5对照。

图3a为mg1655菌株在泳动培养基上培养结果；

图3b为aer基因缺失突变株在泳动培养基上培养结果；

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。【实施例1】利用λ-red重组酶方法对编码大肠杆菌趋氧受体基因aer进行敲除(1)设计引物：

用于同源重组的引物为aer-tet-r和aer-tet-f，设计原则是5'端为aer基因的同源区(未加下划线)，3'端为四环素抗性基因tetra的同源序列(加下划线)，重组体的检测所用引物为jc-aer-r及jc-aer-f。这些引物的序列如表1所示，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1本发明所用的引物

(2)含tetra基因的dna片段的扩增：

以含有四环素抗性基因的大肠杆菌dh10bac的dna为模板，aer-tet-r和aer-tet-f为引物进行pcr扩增，获得两端分别与aer基因上、下游同源，中间为四环素抗性基因tetra的dna片段。将该片段进行琼脂糖凝胶回收，以用于下一步电转化，如图1所示。

(3)感受态细胞的制备：

将含有pkd46质粒的mg1655菌株在含有20μg/mlamp的lb培养基中30℃下过夜培养，之后以1:100的比例接种到含20μg/mlamp的lb中30℃下震荡培养，当od600达到0.6时加入0.2％的阿拉伯糖进行诱导，4小时后4℃下收集细胞，用1/2体积预冷的无菌去离子水洗2次，并浓缩为原体积的1/40，作为感受态细胞备用。

(4)电转及目的菌株的筛选与鉴定

将胶回收的dna片段(100ng)与80μl感受态细胞在电转杯中混合，冰浴5-10min后，用2200v电击，电击后迅速加入1000μllb培养液，30℃下震荡培养30min后在20μg/ml的四环素平板上涂板，37℃下过夜培养，平板上长出的菌落为抗四环素的菌落，对其进一步在四环素平板上划线纯化，并用jc-aer-r及jc-aer-f引物对这些菌落进行菌落pcr鉴定，有四环素抗性基因tetra的dna片段的菌落即为大肠杆菌基因aer敲除的基因增变菌株，如图2所示。

【实施例2】大肠杆菌mg1655aer基因缺失突变株泳动检测

配制泳动培养基：称取nacl5g，胰蛋白胨5g，琼脂粉2g，加蒸馏水1l，121℃灭菌20min，倒平板，待琼脂完全凝固后使用。

分别挑取野生型mg1655和【实施例1】经过jc-aer-r及jc-aer-f引物pcr鉴定的aer基因敲除菌株在lb培养基平板上划线于37℃过夜培养，用灭菌的牙签挑去单菌落用穿刺方法接种在泳动培养基中，然后在30℃培养16h后，观察菌落的生长状况，如图3所示，图3a为野生型大肠杆菌mg1655在泳动培养基上生长的结果，菌落从接种点向四周生长，同时在培养基表面有菌落生长，这是由于培养基表面氧气含量高，趋氧受体基因作用的结果；图3b为敲除趋氧性受体基因aer的菌种在泳动培养基上生长菌落形态，可以看出细菌可以向四周扩散生长，但没有向培养基表面生长的趋势，菌落主要分布在培养基内部，而且生长扩散的速度比野生型菌株有所减缓。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110>武汉生物工程学院

<120>一种趋氧受体基因aer功能丧失的大肠杆菌菌株及制备方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>59

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atcaggcattgtgctccaaccgcccggatccggcataccgactaagcacttgtctcctg59

<210>2

<211>58

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

caagaagttaacaaccatataacctgcacaggacgcgaacttaagacccactttcaca58

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aagatgcgccagcatcgc18

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ggccgacataaactctga18