水稻DPS1基因及其编码蛋白的应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及水稻dps1基因、其编码蛋白及应用。

背景技术：

水稻是我国乃至世界上最重要的粮食作物之一，在我国有超过60％的人口以水稻作为主食，同时随着城市化进程的加快，耕地面积的减少以及生物能源的应用等，对粮食的需求也日益增加。因此，增加水稻产量对解决日益严重的粮食问题具有重要意义。稻穗产量是形成水稻产量的最基本单元，穗大粒多一直是世界水稻育种的重要目标之一。然而穗顶部退化在水稻育种和大田生产中是比较普遍的生物学现象，造成穗子体积减小每穗粒数显著减少，严重影响水稻单产。由于穗顶部退化遗传基础复杂，易受穗分化期间温度、湿度等环境条件的影响，表型鉴定困难或不稳定，目前对于穗顶部退化的分子机制还知之甚少。因此分离水稻穗顶部退化调控新基因，并研究其作用机制，有助于阐明小穗顶部退化的遗传调控机理，克服育种和生产实践中因穗顶部退化引起的产量损失，对于水稻的高产稳产育种具有重要的理论和实践意义。

水稻产量的主要构成因素包括单位面积有效穗数、每穗着粒数、千粒重及结实率等穗部性状。水稻穗的形成起始于茎尖分生组织，在转化为穗轴分生组织后，再经过一级和二级枝梗的分化，最终形成小穗。虽然关于小穗发育阶段的划分目前并无统一标准，但其过程基本一致。水稻在幼穗分化前为营养生长期，当外界环境条件和内部因素适合成花诱导时，顶端分生组织(shootapicalmeristem,sam)上形成若干小的凸起，茎顶端分生组织sam转变为花序分生组织(inflorescencemeristem，im)水稻便进入生殖生长阶段。一些小的凸起转化为一级枝梗分生组织(primarybranchmeristem,pbm)和花序的主穗轴；一段时间后，花序顶端分生组织便停止发育形成退化点，继而一级枝梗分生组织形成二级枝梗分生组织(secondarybranchmeristem,sbm)和小穗分生组织(spikeletmeristem,sm)，它们分别发育为枝梗和小穗。最后，在小穗分生组织上相继形成颖壳、护颖、内稃和外稃、以及雄蕊和雌蕊等花器官原基。穗部结构形成后，水稻进入生殖细胞形成期，雌性生殖细胞(胚囊)发育和雄性生殖细胞(花粉)发育同时进行，这个过程完成后形成一个完整的小穗。随着分子生物学的研究和发展，目前鉴定和克隆的关于水稻小穗发育的基因越来越多，这些基因很多是参与调控各种分生组织转换和起始的基因如腋生分生组织起始的调控基因lax1、lax2、monoculm1(moc1)等，分生组织分化时间的调控基因apo1(anicleorganization1)、taw1(tawawa1)、fzp(frizzypanicle)等，另外生长素、细胞分裂素等激素对小穗发育过程中分生组织的活性也具有重要的调控作用。

水稻的穗分枝数直接决定着穗粒数,而穗粒数是与水稻产量直接相关的关键因素。然而，当水稻穗处于小花发育阶段时，已经形成的小穗容易发生退化，主要表现为出穗后部分颖花及枝梗退化变白，穗成熟后败育脱落。水稻穗部退化主要包括两种类型，分别是穗基部小穗退化和穗顶部小穗退化。影响水稻小穗退化的环境因素主要包括外界的温度、湿度、光照及土壤中营养条件的变化等。角质层发育缺陷及活性氧积累是导致小穗不育退化的两个重要生理因素，角质层除了具有对外界刺激的保护作用外，它还作为交换水和营养物质的选择性渗透膜，避免过度失水。此外，它通过调节信号分子的通道来影响细胞间的通信。角质层缺陷突变体往往表现出部分或完全不育，因此导致种子结实率降低。植物体内活性氧(ros)的异常积累，也会对细胞及其细胞器造成损害，导致细胞程序性死亡。穗顶部小花退化突变体paab1-1，其退化部位积累了过高的过氧化氢和mda。然而，目前关于小穗退化的遗传调控和分子机制却知之甚少。

关于水稻穗基部的遗传机制研究，yamagishi等利用温带粳稻akihikari和非洲旱稻irat109的回交自交系群体为材料，在第1、10和11染色体上发现了3个关于开花前水稻穗基部小花败育的主效qtl。li等(2009)克隆了穗基部退化相关基因sp1，该基因编码一个含有ptr结构域的转运蛋白，在幼穗的韧皮部中表达水平较高，该基因的突变体一级枝梗原基能正常起始和分化，但基部一级枝梗的伸长出现严重障碍，导致基部枝梗和小花退化死亡，最终突变体表现为短穗和千粒重降低，但是sp1调控基部颖花退化的具体分子机理还不是很清楚。系统进化分析表明，sp1与拟南芥中硝酸根转运蛋白atnrt1.2的同源性较高，因此推测sp1可能通过转运硝酸盐向幼穗提供氮素，从而维持小穗的正常生长发育。

与水稻基部小穗退化相比，水稻顶部小穗退化现象在农业生产中更为常见。例如早期高产品种农垦58的小穗退化率达到15％-20％，严重影响了水稻产量，另外已经测序并在生产上广泛应用的优良籼稻品种9311也存在严重的穗顶部退化现象。近年来，穗顶部退化相关的数量性状基因座(qtl)被相继报道。徐华山等(2007)利用日本晴和9311代换系群体，在第1、2、4、7和9染色体上中检测到了5个qtl，其中第9染色体的ds-9位点对穗顶部小穗退化的效应相对较大。tan等在第3染色体上检测到一个qpds3/qmds3位点，该位点对顶部小穗退化贡献率可达11％，并且该位点和第9染色体上的qtl位点在调控穗顶退化方面存在互作效应。王斌等利用重组自交系群体，在第1、2、3、5、6和7染色体上发现了6个控制穗顶部退化的qtl。任三娟等在4号染色体上检测到了与顶部小穗退化相关的qtl位点。高素伟等利用穗顶部退化突变体l-05261发现了5个控制穗顶部退化的qtl，分布在第3、4、5、8染色体上，利用3,3,-氨基联苯胺(3,3'-diaminobenzidine,dab)检测，发现退化小穗中积累了大量过氧化氢物质，推测可能是导致顶部小穗退化的主要原因。z.cheng等发现了一个受光照条件影响的穗顶部退化qtlqpaa8，并将其定位在68kb的范围内，同时也发现穗顶部退化与过氧化氢的积累有关。活性氧作为信号分子，在植物体内的量受到严格调控，在过度积累的情况下，可导致水稻的雄性不育。

由于穗顶部退化受环境因素影响较大，因此精细定位qtl位点并进行候选基因的分离难度很大。近几年国内外研究者利用突变体，鉴定了一系列调控顶部小穗退化的候选基因。qi等(2013)报道了ospup7基因突变后，导致水稻株高增加，抽穗期延长，同时顶部小穗完全退化不育。化学诱变韩国粳稻品种hwacheongbyeo获得穗顶端退化突变体paa-h，该突变体植株变矮，籽粒变小，穗型小且直立，顶部小穗退化，导致穗粒数和千粒重均显著降低。通过图位克隆的方法，将候选基因定位在第4染色体上71kb的区间内，测序发现该区间loc_os04g56160基因编码区存在g到a的碱基突变，导致甘氨酸变为谷氨酸。但该基因调控顶端小穗退化的分子机制还有待进一步研究。水稻穗退化突变体tut1(tutou1)表现为根变短，叶片顶端细胞死亡，株高降低和分蘖减少等，而其最显著的表型是花序顶端小穗退化缺陷。利用图位克隆方法将tut1基因定位于第1染色体上，在小穗、种芽、根、胚芽鞘、茎节和叶片中均有表达，在花器官中表达量最高。该基因编码camp类受体蛋白抑制因子，能促进肌动蛋白成核和体外聚合。另外，tut1突变体穗顶端退化表型与角质层的解体和缺陷密切相关，暗示角质层的形成影响水稻穗的发育。最近又陆续克隆了穗顶部退化基因osalmt7(aluminum-activatedmalatetransporter)和spl6(squamosalpromoter-bindingprotein-like)。osalmt7基因是由万建民院士团队(2018)利用一个穗顶部小花退化突变体paab1-1克隆获得，该突变体的穗顶部退化是幼穗生长后期的一个程序性细胞死亡和dna片段化过程。osalm7基因位于第2染色体上，编码一个具有转运苹果酸功能的质膜蛋白。苹果酸的积累在突变体小穗中呈梯度减少，外源补充苹果酸能恢复突变体顶部小穗的正常表型.这些结果表明osalmt7介导的苹果酸转运在维持水稻穗的正常生长发育中起着重要作用。spl6基因在穗发育过程中呈现顶端高水平表达样式，该基因编码一水稻sbp-box家族转录因子，抑制细胞内质网胁迫感应因子ire1(er-stresssensor)的转录，从而控制胁迫信号的输出强度。spl6基因的缺失突变体顶端小穗在正常生长条件下呈现明显的细胞程序化死亡特征，内质网胁迫感应因子(er-stresssensor)ire1的转录水平及蛋白水平显著增加，造成内质网胁迫信号输出失控和下游基因过激表达，导致顶端小穗细胞衰老退化和穗“秃顶”性状产生。

迄今为止，虽然已经在水稻中克隆了几个顶部小穗退化相关基因，但是关于顶部小穗退化的分子机理仍未解析清楚，有待于构建更加完善和精细的水稻顶部小穗退化分子调控网络。另外，能被有效应用从而降低小穗退化率的基因也未被发掘。因此分离穗顶部退化表型稳定的突变体，克隆相关基因并阐明其功能，对进一步解析水稻穗顶部退化调控机制及在分子育种实践中开发分子标记对这一不利性状进行早期识别和淘汰具有重要的指导意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供能降低水稻顶部小穗退化率的基因与应用。

本发明首先提供的水稻dps1蛋白，其具有：

1)如seqidno.3所示的氨基酸序列；或

2)seqidno.3所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

本发明提供了编码水稻dps1蛋白的基因，其具有：

1)seqidno.2所示的核苷酸序列；或

2)seqidno.2所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或

3)在严格条件下与1)限定的dna序列杂交的核苷酸序列。

含有上述基因的生物材料属于本发明的保护范围，所述生物材料为载体、转基因细胞系、工程菌、宿主细胞或表达盒。

本发明通过ems诱导粳稻圣稻16的方法筛选获得一株水稻顶端退化突变体dps1(degeneratedpanicleandspikelet1,dps1)。

本发明通过比对突变体与圣稻16的dps1基因组序列，发现突变体dps1突变体中dps1基因第11个外显子和第11个内含子拼接位点处发生了g到a的单碱基突变(该突变位于seqidno.1的第7427位核苷酸)。根据这一突变，本领域技术人员可以基于该位点开发用于辅助育种的分子标记。

在生长发育的早期，dps1突变体的营养生长和生殖生长均是正常的，与野生型相比没有明显的差异，并一直持续至幼穗发育到10cm左右；当幼穗达到12cm左右时，突变体穗子顶端小穗呈浅白色、发育停滞，出现明显的退化现象；随着稻穗的进一步发育，顶端退化小穗持续增加，开花期之前当穗子达到最终长度时，这种退化现象变得尤为明显，表现为干瘪坏死，退化的小穗数约占全穗的10％，紧临顶部退化小穗的中间小穗也受到影响，表现为不育，导致结实率和穗粒数均极显著降低。dps1突变体顶部小穗抗氧化系统酶sod、cat活性降低，过氧化氢积累，发生了以核dna损伤为特征的细胞程序性死亡。

本发明提供了所述水稻dps1蛋白或其编码基因或含有该基因的生物材料在制备转基因植物中的应用。

本发明提供了所述水稻dps1蛋白或其编码基因或含有该基因的生物材料在水稻穗型改良或遗传育种中的应用。

本发明提供了所述水稻dps1蛋白或其编码基因或含有该基因的生物材料在提高水稻结实率、穗粒数或提高水稻产量中的应用。

本发明提供了所述水稻dps1蛋白或其编码基因或含有该基因的生物材料在恢复顶端小穗育性中的应用。

本发明提供了所述水稻dps1蛋白或其编码基因或含有该基因的生物材料在提高水稻穗顶部小穗抗氧化系统酶sod、cat活性中的应用，或在改善水稻穗部细胞程序性死亡中的应用。

本发明提供了所述水稻dps1蛋白或其编码基因或含有该基因的生物材料在减少水稻穗顶部退化中的应用。

本发明进一步提供了与水稻顶部小穗退化性状相关的分子标记，该分子标记是dps1基因第11个外显子和第11个内含子拼接位点处发生了g到a的单碱基突变，即位于seqidno.1的第7427位核苷酸的snp分子标记，其多态性为g/a。

基于本发明提供的dps1基因的用途，本领域技术人员可以理解，该基因的分子标记可用于水稻育种、筛选高产水稻或淘汰穗顶部退化水稻。

本发明的优点在于，本发明发现dps1基因具有调控水稻顶部小穗退化的功能，能够降低或减少水稻顶部小穗退化的发生率，进而提高水稻产量，该基因还可应用于水稻穗型的定向设计，并可作为重要的基因资源，有助于在分子育种实践中开发分子标记对穗顶部退化进行早期识别和淘汰，对水稻产量的提高具有重要的指导意义。

附图说明

图1为dps1突变体与野生型圣稻16的表型。

图2为dps1基因定位与结构图。

图3为载体pcambia1305.1::dps1结构示意图。

图4为载体pcambia1305.1-apfhn::dps1结构示意图。

图5为pcambia1305.1::dps1和pcambia1305.1-apfhn::dps1转化水稻dps1突变体均可恢复其表型。

图6为dps1基因在水稻各组织中表达模式分析图。

图7为水稻dps1突变体顶部小穗过氧化氢积累及抗氧化系统酶活性降低，发生了以核dna损伤为特征的细胞程序性死亡。

图8为对dps1突变体顶端小穗细胞进行彗星分析结果图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中使用的水稻(oryzasativa)品种圣稻16为标准品种，水稻穗顶部退化突变体dps1来自中国农业科学院作物科学研究所。

实施例1突变体的获得与表型分析

利用甲基磺酸乙酯(ems)诱变粳稻圣稻16，筛选获得一个穗顶端退化突变体dps1(degeneratedpanicleandspikelet1,dps1)(图1的a)。在生长发育的早期，dps1突变体的营养生长和生殖生长均是正常的，与野生型相比没有明显的差异，并一直持续至幼穗发育到10cm左右(图1的b,图1的c)；当幼穗达到12cm左右时，突变体穗子顶端小穗呈浅白色、发育停滞，出现明显的退化现象(图1的d,图1的e)；随着稻穗的进一步发育，顶端退化小穗持续增加，开花期之前当穗子达到最终长度时，这种退化现象变得尤为明显，表现为干瘪坏死(图1的f)。

统计结果表明，dps1突变体每穗顶端退化的颖花数大约占全穗的10％，导致与野生型(粳稻圣稻16)相比，dps1突变体每穗小穗数显著减少(wt:226±22；dps1:171±13)(图1的g,图1的h)。

进一步考察了紧临顶部退化小穗的中间小穗的发育情况，结果发现，稻穗的中间部分也受到了影响，表现为不育，而基部小穗生长状况良好，最终导致dps1突变体的穗粒数(wt:214±20；dps1:66±10)、结实率均显著降低(wt:94.91％±1.97％；dps1:38.35％±5.2％)(图1的i,图1的j)。以上结果表明，dps1突变体的穗顶部退化对农艺性状造成了严重的不利影响。

实施例2水稻dps1基因的获得

将dps1突变体与表型正常的籼稻品种黄华占杂交，f1表现正常，在f2代分离群体中，正常单株和突变体单株符合3:1的分离比例，由此表明突变性状受一对隐性基因控制。以f2的30个突变体为材料，利用均匀分布于水稻12条染色体上的170个indel标记，将候选基因定位于第5染色体indel标记m1和m7之间。为了精细定位该基因，将f2群体扩大到472个突变单株，并将候选基因定位于indel标记m3和m5之间28.85kb的范围内(图2的a)。该区间内包含6个开放阅读框，其中编号为os05g0395300的基因序列，其基因功能与表型有关，为此分2段对该基因的全长基因组dna进行pcr扩增，每段大小为3.6kb左右，所用引物见表1，使用dnastar软件分析野生型和突变体的测序结果。在dps1突变体中，该基因第11个外显子和11个内含子的拼接位点处，发生了g到a的单碱基突变(图2的b)。rt-pcr结果表明，该突变导致mrna拼接错误，产生了不同于正常野生型的两个错误的转录本(图2的c)。将野生型中该基因的正常转录本进行测序，所用测序引物见表1。测序结果显示，核苷酸序列结果如seqidno.2所示，氨基酸序列如seqidno.3所示。实施例2中涉及的引物序列如表1所示。

表1

实施例3pcambial305.1：：dps1载体转化水稻dps1突变体

为了进行功能互补实验，分别构建了由自身启动子驱动的dps1基因功能互补载体和水稻actin1启动子驱动的过表达载体。dps1基因功能互补载体由基因自身启动子驱动，选取翻译起始位点atg前2011bp作为基因的启动子，以基因组dna为模板进行pcr扩增，所用扩增引物如表2所示的dps1-gdna-c。5’端引入ecori位点和3’端引入spei位点，pcr产物长为9685bp(如seqidno.1所示序列)，最终将自身启动子连同整个基因组dna(如seqidno.1所示序列)一起克隆到pcambial305.1载体中，组成由自身启动子驱动的互补载体(图3)。

另外使用植物双元表达载体pcambial305.1-apfhn构建过量表达载体，以cdna为模板进行pcr扩增，所用扩增引物如表2所示的dps1-cds-c。5’端引入ncoi位点和3’端引入spei位点，pcr产物长为1587bp(如seqidno.2所示序列)，重组到pcambia1305.1-apfhn的ncoi和spei位点中去，由组成型高表达的水稻actin1启动子驱动。构建好的载体如图4所示。

将构建好的互补载体与过表达载体用电击法转入农杆菌eha105，水稻dps1突变体种子诱导愈伤作为受体材料，用农杆菌介导的转化方法进行水稻的转化。由自身启动子驱动的功能互补载体获得了28个独立转化株系，其中22个恢复为野生型表型(图5的a,图5的c,图5的f)。而由actin1启动子驱动的过表达载体获得了10个独立转化株系，其中8个恢复为野生型表型(图5的b,图5的c,图5的g)。与野生型(图5的d)和dps1突变体(图5的e)对比，发现转基因株系不再显示穗顶部退化，结实率和小花结构均恢复至野生型水平。这些结果表明，确实是由于dps1基因的突变造成了dps1突变体穗顶部退化的表型。实施例3中涉及的引物序列如表2所示。

表2

实施例4水稻dps1基因表达模式

采用real-timepcr的方法分析了dps1在叶片、叶鞘、茎、根、不同发育阶段的幼穗及花药等组织中的表达情况，结果如图6所示，尽管dps1在所有组织中均有表达，但在各个组织中的表达水平不尽相同，其中在叶片、花药以及发育后期的稻穗中表达水平最高，并且开花前的穗子(p16)显著高于其他时期的穗子(p3、p8、p10、p12)，这种表达模式与该基因的功能作用是一致的，dps1突变体开花之前的穗子其顶端小穗退化现象也尤为明显。实施例4中涉及的引物序列如表3所示。

表3

实施例5dps1突变体顶部小穗过氧化氢积累及抗氧化系统酶活性降低

活性氧(reactiveoxygenspecies，ros)是引起细胞程序性死亡的一个重要因素，并且研究表明活性氧可以诱导植物和动物组织的细胞死亡。因此推测dps1突变体穗子中活性氧水平的提高导致了细胞死亡的增加。过氧化氢是相对稳定的活性氧分子，本实施例对野生型和突变体进行了dab(3,3'-diaminobenzidine)染色，检测过氧化氢的积累情况。结果表明dps1突变体顶部小穗颖壳在dab染色下，呈现较深的黑褐色沉淀，而相同处理下的野生型顶部小穗颖壳染色没有明显加深(图7的a)。进一步取野生型和突变体不同发育阶段的顶部小穗组织，对其过氧化氢含量进行了定量分析，结果表明，在dps1突变体6cm的幼穗中，过氧化氢的含量与野生型并无差异；当幼穗达到8cm时，dps1突变体中过氧化氢的含量开始显著高于野生型，特别是幼穗达到12cm、15cm阶段时，这种差异更为明显(图7的b)。

本实施例也测定了丙二醛(mda)的含量，它是活性氧导致的膜脂过氧化的一个重要指标，结果发现，突变体顶部小穗的mda含量显著高于野生型(图7的c)。以上实验表明，突变体顶部小穗出现了活性氧的积累，同时也暗示其活性氧的清除能力降低，为此本发明进一步测定了抗氧化系统酶的活性。结果显示，突变体顶部小穗中超氧化物歧化酶(sod)和过氧化氢酶(cat)的活性显著降低(图7的d,图7的e)。推测dps1突变体中活性氧清除系统缺陷致使活性氧积累，进而导致了顶部小穗细胞的程序性死亡。

为了进一步确认dps1突变体中出现了以程序性细胞死亡为基础的dna损伤，对dps1突变体顶端小穗细胞进行了彗星分析，彗星分析可以有效检测并定量细胞中dna单、双链缺口损伤的程度。将所需组织的细胞裂解后，用结合dna的荧光染料进行染色，由于染色体dna从细胞核内迁移出来，dna损伤程度较高的细胞迁移形成“彗星”状图像，而未损伤的dna部分则保持球形。dps1突变体顶部小穗大约45％的细胞显示出高程度的dna损伤(50％的拖尾)，29％的细胞有30％的拖尾，14％的细胞有10％的拖尾，仅仅有12％具有最低程度的损伤(1％的拖尾)。而在野生型顶部小穗中仅仅有3％的细胞具有高程度的dna损伤(50％的拖尾)，而大部分细胞(43％)具有最低程度的损伤(1％的拖尾)。由此可见，dps1突变体中出现了以核dna降解为特征的程序性细胞死亡，进而导致了顶部小穗的退化(图8)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>水稻dps1基因及其编码蛋白的应用

<130>khp191112936.3

<160>31

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>9685

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

aactcacgcatgcatgctgctgttgctgtcgtgatcagtaccatgcactcgaacggtgct60

acgcacatgcatgaggccgattgctgtcgttcttcatgctgagatagccgagcaacgcgt120

cgcatgaacgagcccacttcgctcgaccgaaacccggcgcggtggcggcgtctcgagacc180

agcgccggagatggcggagtccgcgggagcggaggctgcgcgcggcccggcggagacgga240

cttgcccgaggcgagcagaggagccggccagcgcgtgcatgcttgctgcgatgctgcggc300

ggcaaagtacccgcgatgctccagcacggggccgcgagctcgccgcgatgggcatggtct360

tgctgtccggcgccagccggaggcagccatgcggccgcggaaggggtggaaccgctgccc420

ctgcttgcttcgcccgtcgcggcgtcgcgctccccatctcccgtctgctttgctcgtgcg480

cgctgtcccgccgcacatcatcggccgagccgtgcccgcgcgccgcctacgccccgcatg540

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tgcccccgcgctcgcccgccgcccgcatccgcgctcggccatcgctgctgcgcccgctgc720

cgacctgaaggaaaagagaggagagaaaagaaaagagaagaggagaagaaaagaggagaa780

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