一种靶向高尔基体的硫化氢荧光探针、制备方法与应用与流程

本发明属于荧光探针领域，具体涉及一种喹啉类化合物作为靶向高尔基体的荧光探针及其在测量、检测或筛选硫化氢和活细胞荧光成像方法中的应用；本发明还提供了制备所述荧光探针的方法。

背景技术：

硫化氢是具有刺激性和窒息性的无色气体.低浓度接触仅有呼吸道及眼的局部刺激作用,高浓度时全身作用较明显,表现为中枢神经系统症状和窒息症状.硫化氢具有"臭鸡蛋"气味,但极高浓度的硫化氢会很快引起嗅觉疲劳而不觉其味.硫化氢会对眼和呼吸道粘膜产生强烈的刺激作用.硫化氢吸收后主要影响细胞氧化过程,造成组织缺氧.轻者主要是刺激症状,表现为流泪,眼刺痛,流涕,咽喉部灼热感,或伴有头痛,头晕,乏力,恶心等症状，另外,内源性硫化氢已被证明是一种神经调节剂，同时还提供细胞保护剂、神经保护剂、抗炎剂、抗氧化剂、细胞凋亡剂等。

鉴于此，发展能够有效检测特别是在特定细胞器中对硫化氢的含量波动进行监测的分析方法是极其重要和有意义的。现如今已报导的检测硫化氢的分析方法包括汞量法、检测管法、亚甲基蓝比色法等方法。在这些众多的检测方法中荧光探针由于其特有的优点而成为研究人员关注的焦点。然而，目前报道的荧光探针仍存在一些问题，包括选择性不够好、响应速度不够快、合成复杂。由于生命体内的其他成分如丙氨酸(ala)、苯丙氨酸(phe)、蛋氨酸(met)、甘氨酸(gly)、谷氨酸(glu)、精氨酸(arg)、赖氨酸(lys)、色氨酸(trp)、硫酸根(so42-)、亚硫酸氢根(hso3-)、氯离子(cl-)、碳酸根(co32-)、碳酸氢根(hco3-)、硝酸根(no3-)、亚硫酸根(so32-)、过氧化氢(h2o2)、次氯酸根(clo-)等存在，对硫化氢的检测构成潜在干扰，因此，发展快速，高选择性、高灵敏度、合成简单的硫化氢荧光探针，尤其是具有靶向高尔基体功能的硫化氢荧光探针成为本领域技术人员亟待解决的课题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的是在于提供一类快速超灵敏高选择性硫化氢荧光探针荧光探针，以及它们的制备方法和用途，具有合成简单、选择性好、灵敏度高的特点，并且能够表现出优益的高尔基体靶向定位效果，且能对高尔基体中的硫化氢进行测量、检测或筛选和成像。

具体而言，本发明提供了一种化合物，具有式(ⅰ)所示的结构：

r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7和r8为氢原子，直链或支链烷基，直链或支链烷氧基，磺酸基，酯基，羧基；r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7和r8可以相同或不同。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明的化合物是r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7和r8均为氢原子的式(i)化合物，其结构式如下：

本发明还提供了式(ⅰ)或式(ⅱ)化合物的制备方法，包括如下步骤：将式(iii)化合物与亚硝酸钠溶于盐酸中，冷水搅拌0.2-24小时，然后加入叠氮化钠，冷水搅拌0.5-24小时，然后常温搅拌0.2-24小时，将反应液抽滤，得到粗产品，分离提纯，得纯净式(i)化合物，其反应式如下：

式(ⅱ)，r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7和r8为氢原子，直链或支链烷基，直链或支链烷氧基，磺酸基，酯基，羧基；r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7和r8可以相同或不同。

在本发明的一些具体实施方案中，将式(iii)化合物与亚硝酸钠溶于盐酸中，二者的摩尔比为1:1-1:5，冷水搅拌一段时间0.5-3小时，然后加入叠氮化钠，叠氮化纳与已加入亚硝酸钠的摩尔比为1:1-1:10，冷水搅拌0.5-10小时，然后常温搅拌0.5-5小时，然后，将反应液进行抽滤，得到粗产品。将固体产物用色谱柱进行分离提纯，以二氯甲烷和石油醚为洗脱剂，得到纯净的式(ⅰ)化合物。

在本发明的一些具体实施方案中，将r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7和r8为氢原子的式(iii)化合物与亚硝酸钠溶于盐酸中，二者的摩尔比为1:1-1:5，冷水搅拌一段时间0.5-3小时，然后加入叠氮化钠，叠氮化纳与已加入亚硝酸钠的摩尔比为1:1-1:10，冷水搅拌0.5-10小时，然后常温搅拌0.5-5小时，然后，将反应液进行抽滤，得到粗产品。将固体产物用色谱柱进行分离提纯，以二氯甲烷和石油醚为洗脱剂，得到纯净的式(ⅱ)化合物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述洗脱剂，二氯甲烷和石油醚的体积比为1:1-1:2。

本发明还提供了用于测量、检测或筛选硫化氢的荧光探针组合物，其包含本发明的所述式(i)化合物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述式(i)化合物具有以下结构：

在本发明的一些具体实施方案中，所述荧光探针组合物进一步包含溶剂、酸、碱、缓冲溶液或其组合。

本发明还提供了检测样品中硫化氢的存在或测定样品中的硫化氢含量的方法，其包括：

a)使所述式(i)或式(ⅱ)化合物与样品接触以形成荧光化合物；

b)测定所述荧光化合物的荧光性质。

在本发明的一些具体实施方案中，所述样品是化学样品或生物样品。

在本发明的一些具体实施方案中，所述样品是包括水、血液、微生物或者动物细胞或组织在内的生物样品。

在本发明的一些具体实施方案中，所述生物样品是高尔基体。

本发明还提供了检测样品中硫化氢的存在或测定样品中的硫化氢含量的试剂盒，其包含所述式(i)或式(ii)化合物。

本发明还提供了所述式(i)或式(ii)化合物在细胞荧光成像中的应用。

本发明还提供了所述式(i)或式(ii)化合物在靶向定位高尔基体测量、检测或筛选硫化氢中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：

(1)选择性高，抗干扰能力强

本发明的硫化氢探针可选择性的与硫化氢发生特异性反应，生成荧光变化的产物，相较于常见的其他金属离子及生命体内的其他物质，本发明荧光探针显示出了较高的选择性，并且抗干扰能力强。

(2)灵敏度高

本发明的硫化氢荧光探针与硫化氢反应非常灵敏，从而有利于对硫化氢的检测。

(3)可生理水平条件下应用，靶向高尔基体效果佳

本发明的硫化氢荧光探针可在生理水平条件下应用，并且，生物体内常见的金属离子和其他物质对其干扰较小，能够准确对高尔基体中的硫化氢进行测量、检测或筛选，可以应用于活细胞荧光成像。

(4)稳定性好

本发明的硫化氢探针的稳定性好，进而能够长期保存使用。

(5)合成简单

本发明的硫化氢荧光探针合成简单，有利于商业化的推广应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1(a)探针(5μm)加入h2s(0-100μm)前后的荧光光谱；

图1(b)探针(5μm)定量分析不同浓度硫化氢(0-30μm)的工作曲线；

图2人体内常见的物质对探针(5μm)的荧光强度的影响。其中编号1-20分别为空白探针(5μm)、丙氨酸(ala)、苯丙氨酸(phe)、蛋氨酸(met)、甘氨酸(gly)、谷氨酸(glu)、精氨酸(arg)、赖氨酸(lys)、色氨酸(trp)、丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)、天冬氨酸(asp)、脯氨酸(pro)、亮氨酸(leu)、钾离子(k+)、钙离子(ca2+)、钠离子(na+)、镁离子(mg2+)、硫酸根(so42-)、硫化氢(100μm)，除特殊标注外分析物的浓度均为1mm。柱状图代表的是不同分析物存在下探针在518nm处的荧光强度值；

图3人体内常见的物质对探针(5μm)识别硫化氢的干扰能力测试。其中编号1-20分别为空白探针(5μm)、丙氨酸(ala)、苯丙氨酸(phe)、蛋氨酸(met)、甘氨酸(gly)、谷氨酸(glu)、精氨酸(arg)、赖氨酸(lys)、色氨酸(trp)、丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)、天冬氨酸(asp)、脯氨酸(pro)、亮氨酸(leu)、钾离子(k+)、钙离子(ca2+)、钠离子(na+)、镁离子(mg2+)、硫酸根(so42-)、硫化氢(100μm)，除特殊标注外分析物的浓度均为1mm。柱状图代表的是不同分析物存在下探针在518nm处的荧光强度值；

图4利用探针和商用高尔基体对不同细胞进行标记实验

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行、清楚完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，不应该用来限制本发明的保护范围。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

实施例1：式(ii)化合物的合成

合成设计路线如下：

实施方案1：将288mg(1mmol)4-苯基-2三氟甲基-7氨基喹啉与亚硝酸钠69mg(1mmol)溶于盐酸中低温(0℃)搅拌1h，然后加入叠氮化钠130mg(2mmol)，低温(0℃)搅拌1h后常温搅拌1h；然后，将反应液进行抽滤得到粗产品；最后，用二氯甲烷和石油醚的混合体系(v/v,1:1)为洗脱剂进行色谱柱分离，得到暗红色纯净产品195mg，产率为62％。

实施方案2：将288mg(1mmol)4-苯基-2三氟甲基-7氨基喹啉与亚硝酸钠138mg(2mmol)溶于盐酸中低温(0℃)搅拌1h，然后加入叠氮化钠260mg(4mmol)，低温(0℃)搅拌1.2h后常温搅拌1h；然后，将反应液进行抽滤得到粗产品；最后，用二氯甲烷和石油醚的混合体系(v/v,1:1)为洗脱剂进行色谱柱分离，得到暗红色纯净产品204mg，产率为65％。

实施方案3：将288mg(1mmol)4-苯基-2三氟甲基-7氨基喹啉与亚硝酸钠207mg(3mmol)溶于盐酸中低温(0℃)搅拌1h，然后加入叠氮化钠390mg(6mmol)，低温(0℃)搅拌1.4h后常温搅拌1h；然后，将反应液进行抽滤得到粗产品；最后，用二氯甲烷和石油醚的混合体系(v/v,1:1)为洗脱剂进行色谱柱分离，得到暗红色纯净产品211mg，产率为67％。

实施方案4：将288mg(1mmol)4-苯基-2三氟甲基-7氨基喹啉与亚硝酸钠276mg(4mmol)溶于盐酸中低温(0℃)搅拌1h，然后加入叠氮化钠520mg(8mmol)，低温(0℃)搅拌1.6h后常温搅拌1h；然后，将反应液进行抽滤得到粗产品；最后，用二氯甲烷和石油醚的混合体系(v/v,1:1)为洗脱剂进行色谱柱分离，得到暗红色纯净产品220mg，产率为70％。

实施方案5：将288mg(1mmol)4-苯基-2三氟甲基-7氨基喹啉与亚硝酸钠345mg(5mmol)溶于盐酸中低温(0℃)搅拌1h，然后加入叠氮化钠390mg(6mmol)，低温(0℃)搅拌2h后常温搅拌1h；然后，将反应液进行抽滤得到粗产品；最后，用二氯甲烷和石油醚的混合体系(v/v,1:1)为洗脱剂进行色谱柱分离，得到暗红色纯净产品233mg，产率为73％。

实施例2：测试荧光探针对于硫化氢的浓度梯度

配置多个探针浓度为5μm的平行样品于10ml比色管中，然后将不同浓度的硫化氢(0-100μm)加入到测试体系中，摇晃均匀后静置30min。上述测定是在二甲基亚砜与水＝2:8(0.5mmpbs,ph7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱测试都是在25℃下测得的。

用荧光光谱仪测试其荧光强度变化，从图1a可以清晰的看出，随着硫化氢浓度的增加，518nm处的荧光强度逐渐增强。并且，由图1b可以看出荧光探针(5μm)加入硫化氢(0-30μm)之后荧光强度呈现了良好的线性关系，这证明借助于该荧光探针能够对硫化氢进行定量分析。

实施例3：测试荧光探针对于硫化氢的选择性

分析物包括：1空白探针(5μm)、2丙氨酸(ala)、3苯丙氨酸(phe)、4蛋氨酸(met)、5甘氨酸(gly)、6谷氨酸(glu)、7精氨酸(arg)、8赖氨酸(lys)、9色氨酸(trp)、10丝氨酸(ser)、11苏氨酸(thr)、12天冬氨酸(asp)、13脯氨酸(pro)、14亮氨酸(leu)、15钾离子(k⁺)、16钙离子(ca²⁺)、17钠离子(na⁺)、18镁离子(mg²⁺)、19硫酸根(so4^2-)、20硫化氢(100μm)，除特殊标注外分析物的浓度均为1mm。所有测试条件是二甲基亚砜与水＝2:8(0.5mmpbs,ph7.4)体系中完成，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱都是在25℃下分析物加入30分钟后测得的。具体地，移取50μl的探针储备液(1mm)放进10ml管中，先加入一部分水然后加入2ml二甲基亚砜和0.5mlpbsph7.4(10mm)缓冲溶液，再分别移取100μl上述分析物(2-19)储备液(100mm)加入管内同，最后用水定容至10ml。摇匀，30分钟后测定荧光强度变化。结果如图2所示，图2采集的是发射波长在518nm处的荧光强度。从图2可以看出，探针具有良好的选择性。

实施例4：测试荧光探针的抗干扰性能

分析物包括1空白探针(5μm)、2丙氨酸(ala)、3苯丙氨酸(phe)、4蛋氨酸(met)、5甘氨酸(gly)、6谷氨酸(glu)、7精氨酸(arg)、8赖氨酸(lys)、9色氨酸(trp)、10丝氨酸(ser)、11苏氨酸(thr)、12天冬氨酸(asp)、13脯氨酸(pro)、14亮氨酸(leu)、15钾离子(k⁺)、16钙离子(ca²⁺)、17钠离子(na⁺)、18镁离子(mg²⁺)、19硫酸根(so4^2-)、20硫化氢(100μm)，除特殊标注外分析物的浓度均为1mm。所有测试条件是二甲基亚砜与水＝2:8(0.5mmpbs,ph7.4)体系中完成，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱都是在25℃下分析物加入30分钟后测得的。具体地，移取50μl的探针储备液(1mm)放进10ml管中，先加入一部分水然后加入2ml二甲基亚砜和0.5mlpbsph7.4(10mm)缓冲溶液，再分别移取100μl上述分析物(2-19)储备液(100mm)加入管内同时加入硫化氢100μl(储备液为10mm)，最后用水定容至10ml。摇匀，30分钟后测定荧光强度变化,结果如图3所示。从图3可以看出，生物体内存在的常见离子和物质不会明显干扰探针对硫化氢检测的荧光强度，因此探针具有良好的抗干扰性。

实施例5利用探针和商用高尔基体对不同细胞进行标记实验

先用探针(10μm)分别对hela细胞、huvec细胞、raw264.7巨噬细胞和pc-12细胞孵育30分钟，然后，加入h2s(100μm)继续孵育30分钟，紧接着用磷酸盐缓冲液进行清洗3次，以减少背景荧光，采用共聚焦显微镜进行成像，绿色通道激发波长488nm，收集波长490-560nm；红色通道激发波长633nm，收集波长634-740nm。可以看出该探针有较强的组织穿透性能够检测细胞内的硫化氢，通过与高尔基体染料标记细胞对比，在叠加场以及红绿荧光强度分布图(a4-d4)可以看出两者染色位置基本完全重合，皮尔森相关系数分别为a4：0.93；b4：0.90；c4：0.91；d4：0.92，表现出探针定位高尔基体的优秀能力，具有靶向高尔基体的功能。

虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。