专利名称:生物表面活性剂的制备方法
本发明是一种生物工程。
用微生物来生产表面活性剂是七十年代后期国际生物工程领域中发展起来的一个新课题。微生物在代谢过程中常分泌一些生化产物。其分子结构具有亲水和疏水两种组分，如糖脂类，磷脂类及脂蛋白类等。生物表面活性剂具有乳化、破乳、润湿、增溶、发泡、消泡、抗静电、抗腐蚀等功能，因此应用范围甚广，可应用于石油三次开采，消除石油污染及日化、食品和纺织工业等方面。
根据现在研究情况来看，糖脂是最主要的一类生物表面活性剂。日本花王石碱株式会社用球拟酵母(Torulopsis SP)生产槐糖脂(特许公报昭57-92785，92786)，日本S.Itoh实验室用假单孢菌(Pseudomonas SP)生产鼠李糖脂(J.Anti biotics 23，855，1971)，西德Wagner实验室用红球菌(Rhod-ococcus erythropolis)生产海藻糖单脂及海藻糖二脂(Ger Pat DE-2646505，DE-2646506.DE-2646507)，其中海藻糖脂有良好的表面活性性能，可用于石油三次开采等方面。但上述专利中糖脂的产量仅5-10克/升。
为了使糖脂达到工业化生产水平，必须改进培养方法，提高产量，降低成本。
本发明是一种微生物生产海藻糖脂类表面活剂的方法，具体地说是一种用节杆菌(Arthrobacter Simplex)生产海藻糖单脂和海藻糖四脂的方法。该方法包括用节杆菌在最佳培养条件下，进行代谢调节制备海藻糖脂类化合物或者用节杆菌休止细胞，制备海藻糖脂类化合物。
用本发明的节杆菌在培养条件下，进行代谢调节制备海藻糖脂类化合物的方法，即在节杆菌存在下的培养物中加入酸或碱，调PH至4-8，以0.5-1.5(体积比)/分钟的空气或富含氧气的空气通入培养物，培养温度为20°-40℃，最佳为25°-30℃。在培养液中含有铵盐或硝酸盐作为氮源以及其它为繁殖细胞所必需的无机盐类和生长因子。正烷烃、馏份油、原油、植物油和糖类可作为碳源。发酵终了，发酵液用1-3.5倍量的氯仿∶甲醇为1.5-3∶1(V/V)的溶剂或者用乙酸乙酯提取。
在上述方法中，本发明用节杆菌产糖脂的最佳培养条件是，可用玉米浆、旦白胨、牛肉汁、酵母膏作有机营养源，但用酵母膏最好。酵母膏用量控制在0.1-0.5%。另外该菌对微量元素也有特殊要求Zn++、Mn++、Ca++元素要控制一定量，培养液中含有ZnSO4·7H2O为0.001-0.005克/升。MnSO4·2H2O为0.01-0.05克/升。CaCl2·2H2O为0.01-0.05克/升。使菌体中蛋白质合成控制在一定数量，体内主要进行脂肪代谢。培养液中要控制一定比例的碳、氮源，氮源不能太高。控制碳源和氮源比例为30-40∶1发酵过程中维持PH4-8。不用氨水，而用KOH或NaOH来调节。
用本发明的节杆菌休止细胞，生产表面活性剂的方法。首先将节杆菌培养休止细胞，再用休止细胞直接生产海藻糖脂类化合物先找出利用何种廉价碳源能生产菌体，节杆菌能长于葡萄糖、蔗糖、甘露糖、果糠、废糖蜜、甘油、醋酸盐等碳源，其中废糖蜜和葡萄糖是较合适的碳源，菌体产量能达10克/升。将休止细胞悬浮于磷酸缓冲液、生理盐水、蒸馏水或自来水都能产生糖脂，而以磷酸缓冲液作培养液产糖脂最多。磷酸缓冲液浓度可为0.1-0.5M，PH为4-7培养温度为20°-40℃，最佳温度是25°-30℃。节杆菌休止细胞产糖脂可用各种糖类、正烷烃、馏份油或植物油作碳源，其中正烷烃转化率能达0.4-0.6。
利用本发明的方法，节杆菌休止细胞在地下适当条件下，如温度15°-40℃，通空气，PH控制在4-8，可直接用于石油的三次开采。采用本发明的方法，用节杆菌生产出的糖脂类化合物是海藻糖四脂和海藻糖单脂，二种糖脂间的比例也是随着代谢调节改变的。当氮源非限制培养时，产物主要是海藻糖单脂，而当氮源限制时，产物则主要就是海藻糖四脂。用休止细胞培养时产物极大部分是海藻糖四脂。用本发明的方法生产所得的海藻糖脂可用石油三次开采及日化、纺织、食品等工业。
海藻糖四脂
海藻糖单脂
采用本发明代谢调节的方法，能使海藻糖脂类表面活性剂产量达到25克/升左右，对碳源基质的转化率也能提高一倍。而采用休止细胞生产表面活性物的方法是一种廉价，简便的生产表面活性剂的方法。
本发明方法可用下面例子说明例一一个5升自控生物反应器，装2.0升营养盐溶液，成份为Na2HPO4·2H2O 1克，MgSO4·7H2O 0.5克，FeSO4·7H2O 0.1克，ZnSO4·7H2O 0.005克，KH2PO41克，(NH4)2SO42.5克，MnSO4·H2O 0.01克，CaCl2·2H2O 0.05克，酵母膏1克，溶于1升水中，加200毫升正烷烃，温度30℃，接入节杆菌(Arthrobacter.SP)种子250毫升，转速500转/分，通风2.5立升/分，培养过程中自动加入1N NaOH使PH值维持在6.50，发酵72小时，含表面活性物培养液2升，用二倍量三氯甲烷∶甲醇(V∶V＝2∶1)溶剂提取，得粗糖脂96克，经硅胶柱层析得糖脂56克。
例二休止细胞生产糖脂1.休止细胞培养于把节杆菌培养下列培养液(5升三角瓶装1升培养基)Na2HPO4·2H2O 1克/升，KH2PO41克/升，FeSO4·7H2O 0.25克/升，MnSO4·2H2O 1克/升，KH2PO41克/升，FeSO4·7H2O 0.25克/升，MnSO4·H2O 0.01克/升，CaCl2·2H2O 0.05克/升，葡萄糖30克/升，PH6.8，30℃，振荡培养4天，离心菌体，用0.9% NaCl洗涤两次，再放于0.1M磷酸缓冲液振荡4小时，离心得休止细胞。
2.休止细胞在发酵罐中生产糖脂一个5升自控发酵罐，装2.5升0.1M磷酸缓冲液(PH6.5)，接入相当于25克干重的休止细胞，加入正烷烃200ml，转速500转/分，通风2.5立升/分，培养94小时，终了即用二倍量的二氯甲烷∶甲醇体积比(2∶1)提取，蒸干得粗脂122克。
权利要求
1.一种表面活性剂海藻糖脂类化合物的微生物制备方法，其特征在于用节杆菌作菌种，可以分别通过下列二种方法。(1).节杆菌在最佳培养条件下，进行代谢调节制备海藻糖脂类化合物。(2).用节杆菌休止细胞制备海藻糖脂类化合物。
2.按权项1所述的方法中，其特征在于培养温度为20°-40℃，最佳温度是25°-30℃，PH＝4-8，以0.5-1.5(体积比)/分的空气或富含氧气的空气通入培养物。
3.按权项1所述的方法中，其特征在于发酵后，发酵液用1-3.5倍量的甲醇-氯仿溶剂或乙酸乙酯提取，其中甲醇∶氯仿＝1∶1.5-3(V/V)。
4.按权项1、(1)所述的方法，其特征在于有机营养源可用玉米浆、蛋白胨、牛肉汁、酵母膏，最好用酵母膏，用量为0.1-0.5%。
5.按权项1、(1)所述的方法，其特征是培养液中含有ZnSO4·7H2O为0.001-0.005克/升，MnSO4·H2O为0.01-0.04克/升，CaCl2·2H2O为0.01-0.05克/升。
6.按权项1、(1)所述的方法，其特征是在发酵过程中用KOH或NaOH调节PH至4-8。
7.按权项1、(2)所述的方法，其特征是发酵碳源可以是葡萄糖、蔗糖、甘露糖、果糖、废糖蜜、甘油或醋酸盐，其中废糖蜜、葡萄糖是合适的碳源。
8.按权项1、(2)所述的方法，其特征是休止细胞悬浮于磷酸缓冲液、生理盐水、蒸馏水或自来水中，但最好采用浓度为0.1-0.5M的PH4-7的磷酸缓冲溶液。
9.按权项1、(2)所述的方法，其特征是各种糖类、正烷烃、馏份油或植物油可作为碳源，但最好用正烷烃。
10.按权项1、(2)所述的方法，其特征是节杆菌休止细胞可直接用于石油三次开采。
专利摘要
一种生物表面活性剂的制备方法，该法将节杆菌培养在一种最佳培养条件下，并进行代谢调节，控制适当碳氮比例，能获高产海藻糖脂；另采用节杆菌的休止细胞也能廉价简便地生产海藻糖脂。此海藻糖脂的主要成份是海藻糖四脂。
文档编号C12P19/12GK85104026SQ85104026
公开日1986年11月19日 申请日期1985年5月21日
发明者李祖义 申请人:中国科学院上海有机化学研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan