是否异常的方 法，包括以下步骤：
[0053] A，用特异性MCAM的引物，做定量PCR检测，测定待测肝组织中MACMmRNA的数值；
[0054] B，将步骤A测得的MCAM的数值与正常肝组织中的MCAM的数值进行比较，如测得 的数值高于正常值，则表示被检测肝组织中MCAM的表达异常。
[0055] 在本发明的第十一方面，提供了体外检测肝组织中MCAM蛋白的表达是否异常的 方法，包括以下步骤：
[0056] A，用特异性抗MCAM的抗体检测待测肝组织中MACM蛋白的数量；
[0057] B，将步骤A测得的MCAM的数量与正常肝组织中的MCAM的数量进行比较，如测得 的蛋白数量高于正常值，则表示被检测肝组织中MCAM的表达异常。
[0058] 在本发明的第十二方面，提供了体外检测血清中MCAM蛋白的含量是否异常的方 法，包括以下步骤：
[0059] A，用特异性抗MCAM的抗体检测血清中MACM蛋白的数量；
[0060] B，将步骤A测得的MCAM的数量与正常人血清中的MCAM的数量进行比较，如测得 的蛋白数量高于正常值，则表示被检测血清中MCAM的表达异常。
[0061] 应理解，在本发明范围内，本发明的上述各种技术特征和在下文（实施例）中具体 描述的各技术特征之间都可以相互组合，从而构成新的或优选的技术方案。
【附图说明】
[0062] 图 1，MCAM受YAP的调节。
[0063] (A)筛选可能的YAP靶膜蛋白。如所示在用shRNA转染的Bel-7402或SMMC-7721 细胞中对所示膜蛋白进行蛋白质印迹实验。（B)通过免疫荧光法确定Bel-7402、SMMC-7721 和Huh7细胞中MCAM的定位。标尺，10yM。（C)YAP不影响MCAM稳定性。
[0064] 将转染有空或YAP-FLAG表达质粒的Bel-7402细胞用CHX(50yg/ml)处理0或24 小时，然后收获用来进行蛋白质印迹实验。MCAM的蛋白表达水平表示为MCAM与GAPDH之间 的比率，将0时任意设定为为100%。（D)如所示从用shRNA转染的Bel-7402或SMMC-7721 细胞中提取RNA并进行qPCR实验。如所示收获转染有不同表达质粒的Bel-7402细胞用 来进行qPCR实验。数据显示为来自三个独立实验的平均值+标准偏差。*，p〈0, 05,和 **，p〈0,01，用t检验。（E)来自TMA的MCAM和YAP的代表性IHC染色图像。数据用卡方检 验（Chi-squaretest)进行分析。
[0065]图2，CREB是调节MCAM的YAP依赖性转录伙伴。
[0066](A)MCAM基因的启动子分析。如所示，将含截断型MCAM启动子的pGL4. 21质粒与 pRL-TK质粒共同稳定转染入Bel-7402或SMMC-7721细胞中，并将萤火虫萤光素酶活性归一 化至海肾萤光素酶活性。在nt-33?-25之内的可能CRE显示于下。（B)MCAM受PKA控制。 用DMSO、H89 (5-20yM)，或毛喉素（10-50yM)处理Bel-7402细胞24小时，检测细胞中的 MCAMmRNA。将稳定转染有-33-Luc质粒的Bel-7402细胞或SMMC-7721细胞用20yMH89 处理24小时，然后分析细胞中的启动子活性。（C)将转染有空或YAP表达质粒的Bel-7402 细胞用带有CRE的-33-Luc(野生型）或不带有CRE的-33-Luc稳定转染。CRE用灰色矩形 表示。⑶YAP提高CREB诱导的MCAM的上调。如所示将转染有不同质粒的细胞的蛋白质和 RNA样品分别进行蛋白质印迹和qPCR分析。（E)用于CRE扩增的特异性引物用箭头表示。 如所示，在没有抗体或有对照IgG、抗CREB或抗YAP抗体存在下，进行ChIP-qPCR实验。用 抗CREB抗体然后用抗YAP抗体进行连续ChIP实验（Re-ChIP)，也进行了相反顺序的实验。 (F)YAP结合是CREB依赖性的。如所示用转染有shRNA的Bel-7402细胞中的抗CREB或抗 YAP抗体进行ChIP-qPCR实验。图A-F，数据显示为来自三个独立实验的平均值+标准偏差。 *，p〈0, 05,和 #，p〈0, 01，用t检验。
[0067] 图3,MCAM是新的肝癌肿瘤标志物。
[0068] (A)通过抗MCAM抗体染色的TMA的IHC图像（分别为肝癌和正常肝组织）。（B) 来自正常人和原发性肝癌患者的血清MCAM和YAP的蛋白质印迹实验。每个肝癌组和正常组 代表10人份的等量血清样品混合物。（C)正常人、肝硬化、乙型肝炎、丙型肝炎、肝癌患者、 结肠癌患者和乳腺癌患者中血清MCAM的ELISA分析。箱图中的水平线代表中值，箱代表四 分位范围，触须代表第2. 5和97. 5百分位。（D)如ELISA所测，血清MCAM和血清AFP在84 例肝癌血清样品中呈正相关。血清MCAM和血清AFP的值进行Spearman相关性分析。（E) 血清MCAM和血清AFP水平的ROC曲线来检测肝癌。AUC，ROC曲线下面积。（F)小鼠血清及 细胞培养基中的MCAM。如所示带有人肝癌异种移植的小鼠被处死并取血。血清用ELISA分 析。**，p〈0, 01，用t检验。如所示IX107个细胞铺在35mm培养皿上，再培养24小时。离 心，收集培养基上清，并进行ELISA分析。如所示，通过使用抗YAP抗体的蛋白质印迹实验 检测不同细胞系的内源YAP表达水平。（G)人结肠癌组织和正常结肠组织中MCAM表达的 免疫组织化学分析。（H)人乳腺癌组织和正常乳腺组织中MCAM表达的免疫组织化学分析。 (I)经历肝癌切除手术的40名患者在手术前后的血液样品中MCAM的成对t检验。
[0069] 图4,MCAM是细胞存活和转化所需要的。
[0070] (A-B)如基于MTT的增殖分析（A)和胱天蛋白酶3/7活性（B)所检测，MCAM敲减 阻断增殖并诱导Bel-7402细胞中的细胞凋亡，但是不诱导HL-7702中的细胞凋亡。（C)在 不存在或存在MCAM表达质粒的情况下，MCAM或YAP敲减的Bel-7402细胞中无贴壁依赖的 软琼脂集落形成。（D)使用或不使用多柔比星（D〇X〇,0.5yg/ml)处理的情况下，表达YAP 或针对MCAM的shRNA的Bel-7402细胞中胱天蛋白酶3/7活性。（E)沉默Bel-7402细胞 中MCAM或YAP表达抑制体内肿瘤生长。注射后36天测定肿瘤体积（n=每组5只小鼠）。 *，p〈0, 05,和#，p〈0, 01，用t检验。（F)注射了MCAM敲减的Bel-7402细胞的无胸腺裸鼠 的存活显著高于注射了对照细胞（用GFP-shRNA转染）的小鼠。n= 20每组。
[0071] 图5,c-Jun/c-Fos用作MCAM下游效应器。
[0072] (A)如所示，测试转染了GFP-或MCAM-shRNA的Bel-7402细胞中来自信号传导报 道基因的萤光素酶活性（左图）。如所示，测试转染了MCAMshRNA或转染了 1-3ygMCAM 表达质粒的Bel-7402或SMMC-7721细胞中来自c-Jun/c-Fos报道基因的萤光素酶活性 (右图）。将萤火虫萤光素酶活性归一化至海肾萤光素酶活性。（B)在Bel-7402细胞中通 过qPCR检测，MCAM的敲减下调了c-Jun/c-Fos靶基因的mRNA表达。（C)Bel-7402细胞中 c-Jun/c-Fos细胞内定位。箭头，表示用MCAM-HA转染的细胞；*，表示没有成功转染的细胞。 标尺，10yM。（D)如蛋白质印迹所测，MCAM控制c-Jun/c-Fos蛋白质表达。（E)用抗MCAM、 抗c-Jun和抗c-Fos抗体染色的，来自图4E的对照细胞（用GFP-shRNA转染）和MCAM敲 减的异种移植组织的代表性IHC图像。标尺，200yM。（F)YAP调节的c-Jun/c-Fos表达是 MCAM依赖性的。在存在或不存在MCAM-HA表达质粒的情况下，在YAP敲减的细胞中通过蛋 白质印迹实验检测c-Jun/c-Fos蛋白。
[0073] 图 6,AKT是MCAM和c-Jun/c-Fos之间的递质。
[0074] (A)MCAM对AKT有积极作用。如所示，在转染有GFP或MCAM-shRNA的Bel-7402细 胞中不同蛋白的蛋白质印迹实验。（B)MCAM影响AKT定位。通过显微分析，检测瞬时转染 有MCAM-HA表达质粒的Bel-7402细胞中AKT定位。箭头，表示转染有MCAM-HA的细胞；*， 表示没有成功转染的细胞。标有破折号矩形的区域在下左图被放大。标尺，10UM。（C)AKT 结合于MCAM。如所示，MCAM-HA与AKT-Myc共同转染进入Bel-7402细胞。如所示，通过往 复免疫共沉淀检测MCAM和AKT结合。（D)如所示，通过在不同细胞系中进行蛋白质印迹实 验检测蛋白质表达模式。（E)AKT影响c-Jun/c-Fos表达。在AKT敲减或过表达的细胞中对 所示蛋白质进行蛋白质印迹实验。（F)阻断PI3K/AKT降低c-Jun/c-Fos表达和活性。用 DMS0、渥曼青霉素（50yM)或LY294002(20yM)处理细胞24小时，进行蛋白质印迹实验和 qPCR实验检测所示基因表达。S，表示较短暴露；L，表示较长暴露。数据显示为来自三个独 立实验的平均值+标准偏差。*，P〈〇,05,和#，p〈0,01，用t检验。
[0075] 图7,MCAM-AKT轴影响c-Jun/c-Fos的蛋白质合成。
[0076] (A)MCAM和AKT不影响c-Jun/c-Fos的蛋白质稳定性。在存在或不存在MCAM-HA 或AKT-Myc表达质粒的情况下，将Bel-7402细胞用CHX(50yg/ml)处理0或24小时，然后 收获进行蛋白质印迹实验。（B)MCAM诱导eIF4E结合于c-Jun/c-FosmRNA。如所示，经不同 处理的Bel-7402细胞提取物用抗eIF4E抗体和对照非特异性IgG抗体进行RNA-IP实验。 对照IgG和eIF4EIPs中c-Jun/c-FosRNA水平用RT-qPCR检测。还进行无RT的qPCR实 验以排除DNA污染。用特异性抗体免疫沉淀的相对RNA富集被计算为RT-qPCR和无RT的 qPCR的数据间的比例，并表示为相对于输入RNA的百分比。（C)如所示，再不同时间点用 DMS0、渥曼青霉素（50yM)或LY294002(20yM)处理Bel-7402细胞提取物，用抗eIF4E抗 体进行RNA-IP。将"0时"点数据任意设为100%。
[0077] 图8,MCAM对YAP到c-Jun/c-Fos具有正反馈作用。
[0078] (A)如通过pUAS-LUC/TEAD-Gal4 系统在Bel-7402 细胞中所检测，c-Jun/c-Fos对 YAP介导的转录作用的活性提高。