形式结合的抗体可以用原核细胞（例如，大肠杆 菌）中生产的基因产物来免疫动物而产生；与反以后修饰形式结合的抗体（如糖基化火磷 酸化的蛋白或多肽），可以用真核细胞（例如酵母或昆虫细胞）中产生的基因产物来免疫动 物而获得。
[0112] 抗人MCAM蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测标本（尤其是血清样本） 中的人MCAM蛋白。
[0113] 检测方法
[0114] 利用MCAM存在于血清中，且与肝癌密切相关这一特点，本发明还提供了检测或判 断肝癌的方法，尤其是血清学检测方法。
[0115] 在本发明的一个优选实施例中，本发明提供一种检测血清MCAM的ELISA方法以及 时间分辨免疫荧光法（TRFIA)。
[0116] 检测试剂盒
[0117] 基于MCAM与肝癌的相关性，S卩MCAM在肝癌组织中高表达并且在肝癌病人血清中 含量高，因此MCAM可以作为肝癌的一种血清诊断标志物。
[0118] 本发明还提供了一种检测肝癌的试剂盒，它含有本发明的抗MCAM的免疫球蛋白 阔免疫偶联物，或其活性片段；或者含有特异性扩增MCAM的mRNA或cDNA的引物。
[0119] 在另一优选实施例中，本发明还提供了MCAM的诊断试剂盒，包括MCAM诊断试剂盒 或MCAM酶联免疫检测试剂盒。
[0120] 用本发明的人肝癌的血清诊断试剂盒检测为阳性的对象，其患肝癌的几率明显高 于正常人群或一般肝癌患者。
[0121] 药物组合物
[0122] 本发明还提供了一种药物组合物，它含有上述的MCAM的拮抗剂，以及药学上可接 受的载体。所述的药物组合物可用于抑制肝癌细胞的生长。
[0123] 在本发明中，所述的拮抗剂包括针对MCAM的siRNA、反义RNA、抗体，或其组合。此 夕卜，所述的拮抗剂还包括可以降低MCAM表达或活性的小分子化合物。
[0124] 通常，可将MCAM拮抗剂配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质 中，其中pH通常约为5-8,优选为6-8,尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症 而有所变化。配制好的药物组合可以通过常规途径进行给药，其中包括（但不限于）：腹膜 内、静脉内，或局部给药。
[0125] 本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的MCAM拮抗剂以及药学上可 接受的载体或赋形剂。这类载体包括（但不限于）：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇， 及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例 如用生理盐水或含有葡萄糖和其它辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针 剂、溶液宜在无菌条件下制备。活性成分的给药量是治疗有效量，例如，每天约1微克/千 克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其它治疗剂一起使用。
[0126] 使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的MCAM拮抗剂施用于哺乳动物，其 中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千 克体重，优选该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应 考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围内的。
[0127] 本发明的主要优点包括：
[0128] (1)肝癌作为病死率最高的恶性肿瘤之一，早发现早治疗是提高病人存活率的最 有效手段。由于目前肝癌早期诊断的血清标志物较少，发现癌变病人大多为晚期，MCAM是 本发明人首次发现的一个肝癌血清标志物，可应用于肝癌的早期诊断。
[0129] (2)提供了一种新的通过血清标志物检测和判断肝癌的方法，有助于早期检测或 辅助检测肝癌，从而有助于尽早确诊并采取相应治疗措施。
[0130] (3)血清检测方法更方便快速，更容易为病人接受。
[0131] (4)本发明还提供了MCAM应用于肝癌诊断的检测方法和试剂盒，为MCAM的具体实 施提供了可靠保证。
[0132] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，例如Sambrook等，分子克隆：实验室手册（NewYork:ColdSpringHarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和 份数是重量百分比和重量份数。
[0133] 实施例
[0134] 材料和方法
[0135] 血清样品
[0136] 血清样品收集自中国上海瑞金医院中接受肝癌、结肠癌和乳腺癌切除手术的患 者。此项研宄方案经上海交通大学医学院临床研宄与伦理委员会批准。
[0137] 细胞培养、载体和引物
[0138] 将冊1(-2931\11印62、1111117、861-7402、5丽(：-7721、0〇)-1、1^1741'和1-7702 细胞 在DMEM中培养。将细胞用环己酰胺（〇?，501^/1111，518111&，5丨丄〇1118，]\?)川54)、多柔比星 (0? 5yg/ml,Sigma)、渥曼青霉素（50uM,Cayman,AnnArbor,MI,USA)、LY294002 (20uM,Cell signalingtechnology(CST),Boston,MA,USA)或雷帕霉素（50nM,CST)处理 0-24 小时，然 后收获。
[0139] 针对MCAM、c-Fos和c-Jun的ShRNAs购自Genechem公司（中国上海）。针对AKT 和YAP的ShRNAs克隆到pLKO. 1慢病毒载体中。编码人MCAM-HA的cDNA片段购自Origene 公司（中国北京）并亚克隆入pcDNA3. 1(+)载体中。c-Fos和c-Jun表达载体购自Origene 公司。Wnt-报道基因（pTOP-FLASH)、HULC启动子-报道基因和YAP表达质粒如参考文献 所述构建[14-15]。截断的MCAM启动子区进行PCR扩增，用Bel-7402细胞的gDNA为模板， 并克隆入PGL4.21质粒中（Promega，Madison，WI，USA)。用重叠PCR构建突变启动子报道基 因。即-1<：13、(3-]\15^、他、31413和(3-]1111/(3-?〇8报道基因购自1367〇1:;[1116公司（中国海门）。 所用引物全部列于附表S1，如SEQIDN0:3-46所示。
[0140] 免疫组织化学（IHC)、免疫荧光分析（IF)和蛋白质印迹实验（WB)
[0141] 对于IHC，组织微阵列分析（TMA)载玻片购自美国Biomax公司 (R〇ckVille，MD，USA)。IHC的详细操作方案见参考文献[16]。所用的第一抗体为：抗-MCA M(Epitomics,Burlingame,CA,USA, 2505)、抗-YAP(Epitomics, 2060)、抗-c-Fos(CST, 2250) 和抗-c-Jun(CST, 9165)抗体。
[0142] 对于IF，详细的操作方案见参考文献[16]。所用的抗体为：抗-YAP(CST, 4912， 或SantacurzBiotechnology,Santacruz，CA，USA,sc-101199)、抗 _AKT(CST，4691)、 抗-MCAM(Epitomics, 2505)、抗-FLAG(CST, 8146 或 2368)、抗-HA(CST, 2367 抗 3724)、 抗-c-Fos(CST, 2250)或抗-c-Jun(CST, 9165)抗体。
[0143] 对于WB，将蛋白用SDS-PAGE凝胶分离，然后进行标准WB实验。所 用一抗为：抗 _MCAM(Epitomics，2505)、抗-FLAG(Sigma，F3165 或CST，2368)、 抗-HA(CST，3724 或 2367)、抗-Myc(CST，2278 或 2276)、抗-YAP(Epitomics，2060)、 抗-CREB(CST, 9197)、抗-p-CREB(CST, 9198)、抗-AKT(CST, 4691)、抗-p-AKT(CST, 4060)、 抗-p-AKTsubstrate(CST,9614)、抗-GAPDH(CST,5174)、抗-p-mTOR(CST,5536)、 抗1!'01?(〇51'，2983)、抗1170561((〇51'，9234)、抗？70561((〇51'，1175)、 抗-c_Jun(Epitomics，1254)、抗-c-Fos(CST，2250)、抗-4EBP1(CST，9644)、 抗-P_4EBPl(SantaCruz，sc_12884-R)和抗 _eIF4E(abcam,中国香港，ab33766)抗体。
[0144] 细胞增殖、胱天蛋白酶3/7活性、软琼脂分析、萤光素酶报道基因分析、免疫沉淀 (IP)和定量RT-PCR(qPCR)。
[0145] 如所述，通过基于MTT的增殖分析测定细胞增殖[15]。用Caspase-Glo3/7分析 系统（Promega)测定胱天蛋白酶3/7活性。无贴壁依赖的软琼脂生长分析、萤光素酶报道 基因分析、IP和qPCR如参考文献[15]所述进行。
[0146] RNA-免疫沉淀分析（RNA-IP)
[0147] 如参考文献[11]所述进行RNA-IP，免疫沉淀用对照IgG(SantaCruz,sc-2345)或 抗-eIF4E抗体（Abeam,ab33766) (2yg每次反应）。
[0148] 染色质免疫沉淀（ChIP)和Re-ChIP
[0149] 如参考文献[14]所述对lX107Bel-7402细胞进行ChIP分析。将蛋白质-DNA复 合体用3yg抗-YAP(Epitomics，2060)、抗-CREB(CST，9197)，或偶联有蛋白质A/G珠的非 特异性IgG(Santacruz，sc-2345)抗体孵育过夜，然后洗脱。如参考文献[14]所述进行 Re-ChIP分析。DNA用酚/氯仿提取并用乙醇沉淀来纯化，进行qPCR。
[0150] ELISA
[0151]包被96孔Elisa板。将50y1山羊抗人MCAM多克隆抗体（R&Dsystems,Inc.，Cat AF932, 100ng/y1)溶于4, 950y1PBS溶液中。96孔板的每个孔中加入50y1上述稀释 液并于4°C过夜。各孔用0. 05%PBST溶液200y1清洗3次，每次3分钟。各孔加入含有 4%BSA(Sigma,CatA3059-50G)的 100y1PBS，室温封闭 2 小时，然后用 0? 05%PBST溶 液200y1清洗3次，每次3分钟。将10y1血清加入到添加有0. 1 %Tween和1 %BSA的 40