BW-pBAD-ectABC' ；将其中合成能力较佳的一 株重组菌命名为大肠杆菌（Escherichia coli) BW-pBAD-ectABC将该合成能力较佳的大肠 杆菌（Escherichia coli) BW-pBAD-ectABC菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心(简称CGMCC，保藏编号为CGMCC NO. 8334,保藏日期为2013年10月15日，分 类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。保藏中心的地址是北京市朝阳区北辰西路1号 院3号，邮编100101。
[0051] 实施例2、大肠杆菌四氢嘧啶高产菌株BW-pBAD-ectABC中EctABC基因的表达
[0052] 挑取BW-pBAD-ectABC单菌落接入5ml含有氨苄青霉素（100 μ g/ml)的LB培养基 中，于37°C过夜培养。将过夜培养物Iml接种于IOOrnl含有氨苄青霉素（100 μ g/ml)的LB 培养基，37°C剧烈振荡（200rpm)培养，至发酵液的0D_值达到0. 6-0. 8左右，向发酵体系中 加入L-阿拉伯糖（L-阿拉伯糖终浓度为lg/L)，30°C条件下继续培养6小时。设含空载体 大肠杆菌BW-pBAD为阴性对照。
[0053] 发酵完毕后，5000rpm离心15分钟，收集菌体；用pH7. 0的PBS缓冲液重悬菌体， 超声波破碎后12, OOOrpm离心15min。收集上清液，即为含有目的蛋白的粗酶液，SDS-PAGE 检测蛋白表达情况。检测结果见图1。图1中，泳道1表示含空载体大肠杆菌BW-pBAD阴性 对照的检测结果；泳道2为四氢嘧啶高产菌株BW-pBAD-ectABC的检测结果。
[0054] 实施例3、大肠杆菌四氢嘧啶高产菌株BW-pBAD-ectABC的应用
[0055] (-)、菌株发酵及生物转化法制备四氢嘧啶过程
[0056] 1、菌株发酵及EctABC基因的表达
[0057] 挑取BW-pBAD-ectABC单菌落接入20ml含有氨苄青霉素（100 μ g/ml)的LB培养基 中，于37°C过夜培养。将过夜培养物5ml接种于500ml含有氨苄青霉素（100 μ g/ml)的LB 培养基，37°C剧烈振荡（200rpm)培养，至发酵液的OD_值达到0. 6-0. 8左右，再向发酵体系 中加入L-阿拉伯糖（L-阿拉伯糖终浓度为lg/L)，30°C条件下继续培养6小时5000rpm离 心15分钟，收集菌体。
[0058] 2、生物转化反应
[0059] 离心后菌体加入转化液，重悬菌体至0D_值达到10,取50ml重悬菌液于250ml三 角瓶中，30°C振荡（IOOrpm)反应24小时。
[0060] 转化液成分：100mM PBS缓冲液（ρΗ7· 0)中含有200mM L-天冬氨酸钠、10g/L葡萄 糖、10g/L甘油、10g/L KC1。其中，IOOmM PBS缓冲液（ρΗ7·0)的配制方法为：取380ml0. IM 磷酸二氢钠水溶液加入620ml0. IM磷酸氢二钠水溶液配制而成。
[0061](二)、胞内四氢嘧啶的抽提
[0062] 上述生物转化反应完后，离心（8000rpm, 20分钟）收集上述转化后菌体，菌体 于-80°C中预冷30分钟后至于冷冻干燥仪中冻干，称重得干菌体160毫克。
[0063] 称取20mg冻干菌体，加入500ul抽提液(抽提液由体积比为10:5:4的甲醇、氯仿、 水组成)，剧烈震荡1小时，13000rpm离心20分钟促进分相。上清转移至新离心管中，加入 等体积的氯仿与水的混合液(氯仿与水的体积比为1:1 )，剧烈振荡1小时，再次13000rpm离 心20分钟，取上层水相至新离心管中，置于旋转蒸发仪中进行干燥，得到含有四氢嘧啶的 干粉。
[0064] 按上述方法提取胞内四氢嘧啶，直至将160毫克冻干菌体胞内四氢嘧啶提取完 全。
[0065] (三)、胞外四氢嘧啶的抽提
[0066] 离心（8000rpm离心20分钟)收集上清液500ul置于离心管中，加入500ul氯仿剧 烈振荡1小时，13000rpm离心20分钟，上清移至新离心管中并置于旋转蒸发仪中进行干燥， 得到含有四氢嘧啶的干粉。
[0067] 按上述方法提取胞外四氢嘧啶，直至将50ml反应液中的四氢嘧啶提取完全。
[0068](四）、四氢嘧啶HPLC检测
[0069] 上述抽提获得的四氢嘧啶干粉溶于500ul浓度为80% (V/V)的乙腈水溶液中， 0.22um有机型滤器过滤除去不溶物。过滤后样品用80% (V/V)乙腈水溶液适当稀释后 HPLC检测四氢嘧啶浓度。HPLC检测仪为Agilentl260Infinity IX，检测柱为Agilent Z0BAX-NH2氨基柱，紫外检测波长为215nm，流动相80% (V/V)乙腈水溶液，流速为I. OmL/ min,进样量为IOuL,采用外标法按峰面积定量。Sigma四氢嘧啶标准品作为定性及定量标 准。
[0070] HPLC检测结果显示，生物转化反应24h后，从160毫克干菌体和50ml反应液中， 分别共提取胞内四氢嘧啶15毫克、胞外四氢嘧啶170毫克；换算后，每克菌体可以合成I. 1 克四氢嘧啶，其中超过90%的四氢嘧啶分泌至胞外。胞外四氢嘧啶浓度为3. 4mg/ml。
[0071] (五)、大肠杆菌四氢嘧啶高产菌株BW-pBAD-ectABC中四氢嘧啶合成水平的分析
[0072] 按上述(一）-(四）所述方法，分别检测生物转化反应2、4、8、12、16、20、24h后，胞 内四氢嘧啶和胞外四氢嘧啶的量，实验结果见图2所示。
[0073] 图2结果显示，四氢嘧啶的合成量随着生物转化反应时间的增加而增加；生物转 化反应4h后，菌株BW-pBAD-ectABC转化的四氢嘧啶开始分泌至胞外，随着反应时间的延长 胞外四氢嘧啶的浓度显著增加，而胞内四氢嘧啶的含量保持恒定。转化20小时后四氢嘧啶 的分泌速度减缓。生物转化反应24h后，每克菌体可以合成I. 1克四氢嘧啶，其中超过90% 的四氢嘧啶分泌至胞外。
[0074] 实施例4、产四氢嘧啶大肠杆菌重组菌BW-pBAD-ectABC'的应用
[0075] 按照上述实施例3所述的方法（即将实施例3中BW-pBAD-ectABC菌株替换为本对 比例中的BW-pBAD-ectABC'菌株，其它均不变)，利用大肠杆菌重组菌BW-pBAD-ectABC'制 备四氢嘧啶后，检测生物转化反应24h后，胞内四氢嘧啶和胞外四氢嘧啶的量，HPLC检测结 果显示，每克菌体可以合成0.75克四氢嘧啶，其中超过90%的四氢嘧啶分泌至胞外。菌株 BW-pBAD-ectABC的四氢嘧啶合成效率显著高于BW-pBAD-ectABC'。
[0076] 此外，目前已报道的合成四氢啼陡效率最高的是Chromohalobacter salexigens， 每克干菌体可以合成〇. 54克四氢嘧啶。
【主权项】
1. 含有具有下述任一核苷酸序列的核酸片段的重组大肠杆菌或重组载体： 1) 序列表中SEQIDNs:1所不的核昔酸序列； 2) 编码序列表中SEQIDNs:2、SEQIDNs:3和/或SEQIDNs:4所示蛋白质序列的多 核苷酸序列； 3) 在高严谨条件下可与序列表中SEQIDN2 :1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列； 4) 与1)或2)或3)限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质 的DNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上； 再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。
2. 根据权利要求1所述的重组大肠杆菌或重组载体，其特征在于：所述重组大肠杆菌 具体为将所述重组载体导入出发大肠杆菌后得到的重组菌。
3. 根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌或重组载体，其特征在于：所述重组载体 具体为在出发载体pBAD/HisA的多克隆位点插入具有SEQIDNs:1所示核酸序列的DNA片 段所得的质粒；所述出发大肠杆菌具体为大肠杆菌。
4. 根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌或重组载体，其特征在于：所述重组大肠 杆菌具体为大肠埃希氏菌EscherichiacoliBW-pBAD-ectABCCGMCCNO. 8334。
5. 权利要求1-4任一所述的重组大肠杆菌或重组载体在制备四氢嘧啶中的应用。
6. -种制备四氢嘧啶的方法，包括在含L-天冬氨酸钠的溶液中加入权利要求1 -4任一 所述的重组大肠杆菌，经生物转化反应后即得；其中，所述重组大肠杆菌是表达了经过诱导 表达SEQIDNs:2所示蛋白、SEQIDNs:3所示蛋白和SEQIDNs:4所示蛋白的。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述含L-天冬氨酸钠的溶液由溶质和溶 剂组成，溶质及其在所述含L-天冬氨酸钠的溶液中的浓度如下：
溶剂为lOOmM、pH7. 0的PBS缓冲液。
8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述生物转化反应的反应条件为 30°C;和/或，在加入权利要求1-4任一所述的重组大肠杆菌后，可调节菌体溶液0D_值达 到10。
9. 根据权利要求6-8任一所述的方法，其特征在于：所述生物转化反应后，还需进行胞 内和/或胞外四氢嘧啶的抽提； 所述胞内四氢嘧啶的抽提包括：生物转化反应后，离心收集菌体后冻干，将冻干菌体加 入体积比为10:5:4的甲醇、氯仿、水组成的抽提液中震荡1小时，离心取上清，上清液中加 入等体积的氯仿与水的混合液，氯仿与水的体积比为1: 1，振荡1小时，离心取上层水相，干 燥除水后即得； 所述胞外四氢嘧啶的抽提包括：生物转化反应后，离心收集液相，加入等体积氯仿振荡 1小时，离心取上清，移除溶剂后即得。
10. -种利用权利要求1-4任一所述的重组大肠杆菌制备四氢嘧啶的生物反应液，其 组成包括：
【专利摘要】本发明提供了一种高产四氢嘧啶的重组大肠杆菌和利用该重组菌制备四氢嘧啶的方法。本发明提供的重组大肠杆菌是将含有延长盐单胞菌Halomonas？elongate四氢嘧啶合成基因簇EctABC的重组质粒导入大肠杆菌后得到的。本发明的重组大肠杆菌实现了四氢嘧啶合成的三个关键酶在阿拉伯糖启动子的调控下可溶性表达。诱导表达后的菌体以天冬氨酸钠为前体通过生物转化的方法实现了四氢嘧啶的高效分泌型合成。每克菌体可以合成1.1克四氢嘧啶，其中超过90％的四氢嘧啶分泌至胞外。本发明提供的利用该重组菌制备四氢嘧啶的方法，便于产物的下游纯化分离，对四氢嘧啶的工业化生产和大规模应用具有重大意义。CGMCC NO833420131015
【IPC分类】C12P17-12, C12R1-19, C12N15-52, C12N15-70, C12N1-21
【公开号】CN104560844
【申请号】CN201310518176
【发明人】董志扬, 何永志, 张山, 毕建成
【申请人】南京众惠生物材料科技有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月28日