更有利于去除酸性相关蛋 白。洗涤的pH-般在7. 6-7. 9。洗涤过程通常持续20-30CV。当洗涤峰下降至50mAu左右时 即可认为洗涤过程结束。使用85%B第一种洗脱液来进行洗脱，洗脱的pH-般在8. 05-8. 15 之间。洗脱过程一般持续8-15CV。当洗脱峰下降至50mAu左右时即可认为洗脱过程结束。 最后使用第二种洗脱液来洗脱碱性相关蛋白。
[0025] 上样液的酸性相关蛋白的比例控制在50%以下，越低越好。碱性峰比例控制在20% 以下，越低越好。通过层析，可以使主峰的目的蛋白CEX-HPLC纯度由37%提高到70%以上， 使用多步洗涤模式或上样流出模式可以使纯度进一步提高到75%甚至77%以上。目的蛋白 的得率一般在74%以上。
[0026] 本发明中，重组蛋白是在宿主细胞中产生的蛋白，该宿主细胞已被编码该蛋白的 核酸转化或转染，或作为同源重组的结果产生蛋白。可互换使用"转化"和"转染"，指将核 酸引入细胞的过程。在转化或转染后，核酸可以整合到宿主细胞基因组中，或作为染色体外 因子存在。"宿主细胞"包含体外细胞培养中的细胞和在宿主动物中的细胞。例如在美国专 利5, 534, 615中描述了重组产生多肽的方法（纳入本文以供参考）。
[0027] 本发明所述重组蛋白主要指抗体，特别指的是所有结合HER2抗原的重组抗体， 包括但不限于曲妥珠单抗（trastuzumab) (Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 89 :4285-4289(1992))，帕妥珠单抗（pertuzumab) (OMNITARGTM) (TO01/00245)，以及美国 专利 US 64072135、US 5821337、US 6639055、US 6719971、US 6800738、US 6054297、US 5677171、 US 5770195、 US 5720954、 US 5772997、 US 6165464、 US 6387371、 US 6399063、 US 5720937、US 5725856和中国专利CN 01132225. X中提到的所有抗体蛋白。本文所述的 "HER2 抗原"指人 HER2 蛋白，例如在 Semba 等，PNAS (USA) 82 :6497-6501 (1985)和 Yamamoto 等，自然，319:230-234 (1986) (GeneBank 登录号 X03363)中描述的人 HER2 蛋白。
[0028]酸性相关蛋白：是比目标重组蛋白更加酸性（例如用阳离子交换层析测定）的目 标重组蛋白的变体。酸性相关蛋白的例子是脱酰胺变体。
[0029] 碱性相关蛋白：是比目标重组蛋白更加碱性（例如用阳离子交换层析测定）的目 标重组蛋白的变体。碱性相关蛋白的例子是C端赖氨酸不完全去除、N端GLN (谷氨酰胺） 不完全环化作用。
[0030] 混合液：指包含抗体的组合物的术语"混合液"（优选抗HER2抗体)，指存在所需抗 体和其一种或多种酸性变体和碱性变体。酸性变体可以包含占多数的脱酰胺抗HER2抗体 和少量其它酸性变体。已发现例如在获自重组表达的抗J1ER2抗体的制备物中，多达约50% 的抗HER2抗体是脱酰胺化的，约15%的抗体为碱性相关蛋白。
[0031] 阳离子离子交换介质：指一种带负电的固相，因其具有自由阳离子，能交换固相上 或固相中流过的水溶液中的阳离子。附着在固相上形成阳离子交换树脂的带负电的配体可 以是例如羧酸盐或磺酸盐。商业上可购得的阳离子交换树脂是结合在不同基质上的功能 基团为SCV的填料，包含但不限于：羧基-甲基-纤维素、BAKERBOND ABX?、固定在琼脂糖 上的磺酸丙基（sulphopropyl) (SP)(如 GE 的 SP-SEPHAROSE FAST FLOW? 或 SP-SEPHAR0SE HIGH PERFORMANCE?)、固定在聚苯乙烯二乙烯苯基 Polystyrene/divinyl benzene 上的 S0URCE-30S、S0URCE-15S，AB公司的Poros HS Poros XS和固定在琼脂糖上的磺酰基（如 Pharmacia的S-SEPHAR0SE FAST FLOW?)和Bio-rad公司的固定在亲水性聚丙烯酰胺类上 的 NUVIA-S、UN0sphere-S 等。
[0032] 缓冲液："缓冲液"是通过其酸-碱偶联组分的作用来抵抗pH变化的溶液。在缓冲 液，生物系统中缓冲液的制备和使用指南，Gueffroy, D. Ed. CalbiochemCorporation (1975) 中描述了取决于缓冲液所需pH而定的可使用的不同缓冲液。在一个实施例中，缓冲液具有 的pH范围从大约5到大约7 (如下文实施例1)。将pH控制在该范围内的缓冲液的例子包 括：MES、M0PS，M0PS0、磷酸盐、乙酸盐、杵檬酸盐、琥珀酸盐和铵盐缓冲液，以及这些缓冲液 的组合。
[0033] 上样液："上样液"是指用来将含有目标蛋白分子和一种或多种相关蛋白的组合物 加到离子交换树脂上的缓冲液。加样缓冲液具有的电导率和/或PH，能使目标蛋白分子 (和通常一种或多种污染物）与离子交换树脂结合。
[0034] 洗涤缓冲液："洗涤缓冲液"被用来在洗脱目标蛋白前从离子交换树脂上洗脱出一 种或多种相关蛋白。洗涤缓冲液的电导率和/或pH能使相关蛋白从离子交换树脂上被洗 脱下来，但目标蛋白洗脱量很少。
[0035] 洗脱缓冲液：用来将目标蛋白从固相上洗脱下来。洗脱缓冲液的电导率和/或pH 能使目标蛋白从离子交换树脂上洗脱下来。
[0036] 电导率指水溶液在两个电极间传导电流的能力。在溶液中，电流是通过离子运 输的。因此，当水溶液中离子量增大时，溶液将具有更高的导电率。导电率的度量单位是 mmhos/cm(ms/cm)，而且能用导电率计测量（由Orion等出售)。溶液的导电率可通过改变 其中的离子浓度而变化。例如，可改变溶液中缓冲剂浓度和/或盐（如NaCl或KC1)的浓 度，来达到所需导电率。
【附图说明】
[0037] 图1:实施例1得到的终产物的层析图谱；
[0038] 图2:实施例1各组分的CEX-HPLC图谱；
[0039] 图3:实施例2得到的终产物的层析图谱；
[0040] 图4:实施例2各组分的CEX-HPLC图谱；
[0041]图5:实施例3得到的终产物的层析图谱；
[0042] 图6:实施例3各组分的CEX-HPLC图谱；
【具体实施方式】
[0043] 以下实施例仅仅对本发明进行进一步说明，不应理解为对本发明的任何限制。
[0044] 实施例1:上样不流穿，使用单步75%B洗涤、单步85%B洗脱
[0045]层析柱：XK16/40, NuviaS，lCV=50ml，H=25cm，flow=10ml/min
[0046]层析系统：AKTA-PURIFIER
[0047] 操作软件：unicorn系统
[0048] 样品：rhuMAb HER2抗体及相关蛋白混合物，用r-proteinA层析置换到朽1檬酸体 系中，再用TRIS-base调节pH 5. 0,加入氯化钠调节电导为8. 5ms/cm，载量为15mg/ml载 量。总上样量为750mg。
[0049]溶液：
[0050]平衡液 1 :20mmHAC-Na0H+40mm 硫酸铵 pH 5. 0 电导 8. 4ms/cm
[0051]平衡液 2 :20mmHAC-Na0H pH 5. 0 电导 1. lms/cm
[0052] A 溶液：10mmNa2HP04+憐酸 pH :7. 52 电导 1. 5ms/cm
[0053] B溶液：10mmNa2HP04+ 憐酸 pH :9. 36 电导 1. 5ms/cm
[0054]洗涤液 1:100%A
[0055]洗涤液 2:25%A+75%B
[0056]洗脱液 1 :15%A+85%B
[0057]洗脱液 2 :300mmol/L NaCl 电导 26ms/cm
[0058] 操作流程：
[0059] 平衡1 (3CV)-上样-平衡1 (1CV)-平衡2 (2CV)-洗涤液1 (2CV)-洗涤液2 (20CV)-洗脱液1 (12CV))-洗脱液2 (2CV)-2N氯化钠（2CV)-纯化水（lCV)-O.