20代(即培养5个月)的猪粪堆肥富集培养物等比例混合，然后以水稻秸杆为碳源的富集培养基作为传代培养的培养基进行传代培养3个月，即得初始菌群。这5个混合菌群的纤维素降解能力趋于稳定，并最终进入基于丁酸发酵能力的复筛。
[0050]对个筛选的初始菌群的液相发酵产物进行测试，其中，源于牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤和腐木组合的混合菌群丁酸产量最高，为6.0g/L同时丁酸比例也最高，为75.4%。
[0051](2)将富集的菌群接种于种子培养基，静置厌氧培养；培养温度为35°C，培养时间为 14d0
[0052](3)将发酵培养基200mL装入500mL的血清瓶中，115°C灭菌20分钟。将种子培养基加入血清瓶中，接种量5% (v/v)，140rpm进行厌氧液态发酵，培养温度为35°C，培养时间为7d，每24h取样一次，测定丁酸浓度，同时在N2保护下，加入CaCO 3调节发酵系统的pH至
5.5 ?6.00
[0053](4)采用GC法测定丁酸含量，以N2为载气，进样量I μ L，测定丁酸浓度。丁酸终浓度为7.6g/L。
[0054]本实施例所述的富集的菌群包含:梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、拟杆菌属(Bacteroides)和颤螺旋菌属(Oscillospira);
[0055]具体包含以下菌株:纤维素降解菌、半纤维素降解菌、丁酸发酵菌、乙酸发酵菌和其它产酸发酵菌；
[0056]其中，纤维素降解菌包括:化糖梭状芽胞杆菌(Clostridium saccharolyticum)、多糖所装芽抱杆菌(Clostridium polysaccharolyticum)、嗜糖假单胞菌(Pelomonassaccharophila)、纤维化纤维单胞菌(Cellulosimicrobium cellulans)和(Clostridiumphytofermentans)；
[0057]半纤维素降解菌包括:(Bacteroidesgraminisolvens)、(Clostridiumxylanolyticum)、和(Ruminobacillusxylanolyticum)；
[0058]氨基酸降解菌包括:(Aminobacteriumcolombiense)和(Proteiniphilumacetatigenes)；
[0059]丁酸发酵菌包括:柔嫩梭菌(Clostridium Iep turn)和(Roseburiaintestinali)；
[0060]乙酸发酵菌包括:(Clostridiumhathewayi)和(Bacteroides oleiciplenus);
[0061]其他产酸发酵菌包括:(Oscillibactervalericigenes)、(Clostridialesbacterium)、(Bacteroidetes bacterium)和(Sedimentibacter sp) 0
[0062]实施例2
[0063]1、种子培养基配制同实施例1。
[0064]2、发酵培养基配制同实施例1。
[0065]3、发酵工艺
[0066](I)使用的槽式搅拌反应器总容积为22L，发酵体积为20L，接种量为5% (v/v)。反应器外壁缠绕电热丝，通过温控仪将反应系统控制在35±1°C。pH控制在6.0?6.2之间。
[0067](2)通过补料分批发酵模式进行发酵。在补料分批发酵模式中，第4天开始，每天排出3L发酵液，同时补充3L新鲜培养基，包含90g/L预处理水稻稻杆和5g/L蛋白胨。
[0068](3) 丁酸含量测定方法同实施例1，丁酸累计产量为1004g。
【主权项】
1.一种利用混合菌群发酵木质纤维素制备丁酸的方法，其特征在于它是按照以下步骤进tx的: 一、采用富集自牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤和腐木的混合物为初始菌群，以PCS培养基为基础，以预处理稻草秸杆为原料，配制种子培养基和发酵培养基； 二、将初始菌群接种于种子培养基，静置进行厌氧培养； 三、将步骤二培养后的菌群接种于发酵培养基，在140rpm转速条件下进行厌氧发酵，制备丁酸； 四、将步骤三制备的丁酸接种到槽式搅拌反应器中，进行丁酸发酵； 其中，步骤二中厌氧培养条件为:混合菌群培养温度为35°C，培养时间为14d ; 步骤三中接种的种子发酵液的体积为10mL，厌氧培养条件为:培养温度为35°C，培养时间为7d ； 步骤四中发酵液的体积为发酵系统体积的5%，厌氧培养条件为:35°C培养，培养时间为7?15do
2.根据权利要求1所述的一种利用混合菌群发酵木质纤维素制备丁酸的方法，其特征在于步骤一中所述的初始菌群包含以下菌株:纤维素降解菌、半纤维素降解菌、丁酸发酵菌、乙酸发酵菌和其它产酸发酵菌； 其中，纤维素降解菌包括:化糖梭状芽胞杆菌(Clostridium saccharolyticum)、多糖所装芽抱杆菌(Clostridium polysaccharolyticum)、嗜糖假单胞菌(Pelomonassaccharophila)、纤维化纤维单胞菌(Cellulosimicrobium cellulans)和 Clostridiumphytofermentans ； 半纤维素降角军菌包括:Bacteroides graminisolvens、Clostridium xylanolyticum、和 Ruminobacillus xylanolyticum ； 氨基酸降角军菌包括:Aminobacterium colombiense 和 Proteiniphilumacetatigenes ； 丁酸发酵菌包括:柔嫩梭菌(Clostridium Iepturn)和 Roseburia intestinali ； 乙酸发酵菌包括:Clostridium hathewayi 和 Bacteroides oleiciplenus ； 其它产酸发酵菌包括:Oscillibacter valericigenes、Clostridiales bacterium、Bacteroidetes bacterium 和 Sedimentibacter sp。
3.根据权利要求1所述的一种利用混合菌群发酵木质纤维素制备丁酸的方法，其特征在于步骤一中的种子培养基是以PCS培养基为基础配置的种子培养基，以预处理稻草秸杆为原料，其配制方法为:在IL培养基中加入:10g预处理过的稻草、5g蛋白胨、Ig酵母粉、5gNaCl、2g CaCOjP 0.5g半胱氨酸；通入氮气10分钟，以保持培养基厌氧状态，密封，115°C灭菌20分钟。
4.根据权利要求1所述的一种利用混合菌群发酵木质纤维素制备丁酸的方法，其特征在于步骤一中的发酵培养基是为基础配置的种子培养基，以预处理稻草秸杆为原料，其配制方法为:在IL培养基中加入:20g预处理过的稻草、5g蛋白胨、Ig酵母粉、5g NaCl、2gCaCOjP 0.5g半胱氨酸；通入氮气10分钟，以保持培养基厌氧状态，密封，115°C灭菌20分钟。
5.根据权利要求3或4所述的一种利用混合菌群发酵木质纤维素制备丁酸的方法，其特征在于所述的预处理稻草秸杆处理过程如下:将采集的水稻秸杆切割成10?15cm ;将切割后的稻草秸杆置于质量百分含量为I %的NaOH溶液中，在50°C条件下静置72h，过滤去除液体，收集固相物，将固相物用自来水彻底清洗至其PH为中性后，进行挤干，置于4°C中保存，即完成；其中，稻草秸杆与NaOH溶液的质量体积比为Ig:15mL。
6.根据权利要求1所述的一种利用混合菌群发酵木质纤维素制备丁酸的方法，其特征在于步骤一中所述的初始菌群筛选过程为:将采集的样品置于以水稻秸杆为碳源的富集培养基中进行富集培养，在富集培养基中添加一片滤纸条作为指示物，以滤纸条完全崩解为标准，进行连续传代培养5个月，然后将培养后的牛粪、玉米的土壤和腐木富集培养物以及的猪粪堆肥富集培养物等比例混合，然后以水稻秸杆为碳源的富集培养基作为传代培养的培养基进行传代培养3个月，即得初始菌群；其中，采集的样品是从牛粪、沼气渣、猪粪堆肥、水沟底泥、玉米地土壤、灌木丛土壤、腐木以及腐叶中采集的。
7.根据权利要求6所述的一种利用混合菌群发酵木质纤维素制备丁酸的方法，其特征在于所述的以水稻秸杆为碳源的富集培养基其配制方法为:在IL培养基中加入:10g预处理过的稻草、5g蛋白胨、Ig酵母粉、5g NaCl、2g CaCCVfP 0.5g半胱氨酸；通入氮气10分钟，以保持培养基厌氧状态，密封，115 °C灭菌20分钟。
8.根据权利要求7所述的一种利用混合菌群发酵木质纤维素制备丁酸的方法，其特征在于所述的预处理稻草秸杆处理过程如下:将采集的水稻秸杆切割成10?15cm ;将切割后的稻草秸杆置于质量百分含量为1%的NaOH溶液中，在50°C条件下静置72h，过滤去除液体，收集固相物，将固相物用自来水彻底清洗至其PH为中性后，进行挤干，置于4°C中保存，即完成；其中，稻草秸杆与NaOH溶液的质量体积比为Ig:15mL。
【专利摘要】一种利用混合菌群发酵木质纤维素制备丁酸的方法，它涉及一种制备丁酸的方法。本发明的目的是要避免传统方法中纤维素酶的大量使用，完成丁酸的中温混合菌群发酵制备过程，降低制备成本。本发明采用富集自牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤和腐木的混合物为初始菌群，以PCS培养基为基础，以预处理稻草秸秆为原料，配制种子培养基和发酵培养基。其主要步骤如下：A、将富集的菌群接种于种子培养基，静置进行厌氧培养；B、将步骤A培养的菌群接种于发酵培养基，140rpm进行厌氧发酵，制备丁酸；C、将步骤B培养的菌群接种到槽式搅拌反应器中，进行丁酸发酵。
【IPC分类】C12R1-145, C12R1-01, C12P7-52
【公开号】CN104630292
【申请号】CN201510068287
【发明人】李建政, 迟雪, 艾斌凌, 李玖龄
【申请人】哈尔滨工业大学宜兴环保研究院
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月9日