序列时，表示当，例如以GAP 或BESTFIT程序使用缺省空位权重优化比对时，二个氨基酸序列享有至少95%序列同一 性，及甚佳地至少98%或99%序列同一性。优选地，不同的残基位置相差在保守性氨基酸 取代。在二或多个氨基酸序列因保守性取代而彼此不同的案例中，可调高百分比序列同一 性或类似程度以修正取代的保守性质。调整的方法已为熟习本领域者所熟知。参见，例如 Pearson(1994)Methods Mol. Biol. 24：307-331)〇
[0118] 多肽的序列类似性，其亦指序列同一性，通常使用序列分析软件来测量。蛋白分析 软件使用分配至多种取代、删除和其他修饰作用（包括保守性氨基酸取代）的类似度量值 匹配类似的序列。例如，GCG软件含有例如Gap和Bestfit程序，其可以缺省参数使用以测 定密切相关的多肽间，例如来自生物的不同物种的同源多肽，或野生型蛋白和其突变蛋白 间的序列同源性或序列同一性。参见，例如GCG Version 6. 1。多肽序列亦可使用FASTA比 较，利用缺省或建议参数，一种GCG Version 6. 1内的程序。FASTA (例如FASTA2和FASTA3) 提供查询序列和搜寻序列间最佳重迭区的比对和序列同一性百分比（Pears〇n(2000)见上 文）。当本发明序列与含有较大量的来自不同生物体的序列的数据库作比较时，另一优选的 算法为使用缺省参数的计算机程序BLAST，特别是BLASTP或TBLASTN。参见，例如Altschul 等人（1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 及 Altschul 等人（1997)Nucleic Acids Res. 25: 3389-402。
[0119] pH-依赖结合
[0120] 本发明包括具有pH-依赖结合特征的抗-⑶3抗体和抗-⑶3/抗-⑶20双特异性 抗原结合分子。例如，本发明的抗-CD3抗体在酸性pH时，相较于中性pH，可能出现与CD3 结合降低。另外，本发明的抗-CD3抗体在酸性pH时，相较于中性pH，可能出现与CD3结合 增加。表达法"酸性pH"包括低于约6. 2的pH值，例如约6. 0、5. 95、5, 9、5. 85、5. 8、5. 75、 5. 7、5. 65、5. 6、5. 55、5. 5、5. 45、5. 4、5. 35、5. 3、5. 25、5. 2、5. 15、5. 1、5. 05、5. 0 或更低。如 文中所用，表达法"中性pH"指约7. 0至约7. 4的pH。表达法"中性pH"包括约7. 0、7. 05、 7. 1、7. 15、7. 2、7. 25、7. 3、7. 35 及 7. 4 的 pH 值。
[0121] 在某些情况下，"相较于中性pH，在酸性pH时……结合降低"表达为在酸性pH时 抗体与其抗原结合的K D值和在中性pH时抗体与其抗原结合的KD值的比率（或反之亦然）。 例如，就本发明的目的，若抗体或其抗原结合片段出现约3或更大的酸性/中性K D比率，抗 体或其抗原结合片段可能被视为出现"相较于中性PH，在酸性pH时与CD3结合降低"。在 某些示例性实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段的酸性/中性K D比率可为约3. 0、 3. 5、4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0、8. 5、9. 0、9. 5、10. 0、10. 5、11. 0、11. 5、12. 0、 12. 5、13. 0、13. 5、14. 0、14. 5、15. 0、20. 0? 25. 0、30. 0、40. 0、50. 0、60. 0、70. 0、100. 0 或更大。
[0122] 具有pH-依赖结合特征的抗体可例如，通过相较于中性pH，在酸性pH时就与特定 抗原的结合降低（或提高），筛选抗体群体来取得。另外，氨基酸水平的抗原结合结构域的 修饰可能产生具有pH-依赖结合特征的抗体。例如，通过将抗原结合结构域的一或多个氨 基酸（例如在CDR内）以组氨酸残基取代，可得到相对于中性pH，在酸性pH时具有降低的 抗原结合的抗体。
[0123] 包括Fc变体的抗体
[0124] 根据本发明某些实施方式，提供包括Fc结构域的抗-⑶3抗体及抗-⑶3/抗-⑶20 双特异性抗原结合分子，其中该Fc结构域包括一或多个增进或减少抗体与FcRn受体结合 的突变，例如在酸性pH时，相较于中性pH。例如，本发明包括在Fc结构域的C H2或CH3区中 包含突变的抗体，其中该突变增加Fc结构域在酸性环境（例如在其中pH范围从约5. 5至 约6. 0的核内体中）与FcRn的亲和力。当施用于动物时，此等突变可使抗体的血清半寿期 增加。此等Fc修饰的非限定实例包括，例如在位置250(例如E或Q) ;250和428(例如L 或F) ;252 (例如L/Y/F/W或T)、254 (例如S或T)和256 (例如S/R/Q/E/D或T)的修饰；或 位置428及/或433 (例如，H/L/R/S/P/Q或K)及/或434 (例如H/F或Y)的修饰；或位置 250及/或428的修饰；或位置307或308 (例如308F、V308F)和434的修饰。在一实施方 式中，此修饰包括428L (例如M428L)和434S (例如N434S)修饰；428L、259I (例如V259I) 和308?(例如￥308?)修饰；4331((例如114331()和434(例如434￥)修饰；252、254和 256(例 如 252Y、254T 和 256E)修饰；250Q 和 428L 修饰（例如 T250Q 和 M428L);和 307 及 / 或 308 修饰（例如308F或308P)。
[0125] 例如，本发明包括包含Fc结构域的抗-⑶3抗体及抗-⑶3/抗-⑶20双特异性 抗原结合分子，所述Fc结构域包含由下列组成的组中选出的一或多对或组突变：250Q和 248L(例如 T250Q 和 M248L) ;252Y、254T 和 256E (例如 M252Y、S254T 和 T256E) ;428L 和 434S (例如M428L和N434S);以及433K和434F (例如H433K和N434F)。在文中所述的抗体 可变结构域内所有可能的前述Fc结构域突变的组合，和其他突变涵盖在本发明的范围内。
[0126] 抗体和双特异性抗原结合分子的生物特征
[0127] 本发明包括与人类CD3结合及诱导T细胞增殖的抗体及其抗原结合片段。例如，本 发明包括抗-CD3抗体，其当通过活体外T细胞增殖测定法，例如使用文中实例4所定义的 分析模式（例如在抗-CD3抗体的存在下评估Jurkat细胞或人类PBMC的增殖）或实质上类 似的分析测量时，以低于约〇. 33pM的EC5(I值诱导人类T细胞增殖。在某些实施方式中，本发 明的抗体或抗原结合片段，当通过活体外T细胞增殖测定法，例如使用文中实例4所定义的 分析模式或实质上类似的测定法测量时，以低于约〇. 32pM，低于约0. 31pM，低于约0. 30pM， 低于约〇? 28pM，低于约0? 26pM，低于约0? 24pM，低于约0? 22pM，或低于约0? 20pM的ECjt 诱导人类T细胞增殖（例如Jurkat细胞增殖及/或PBMC增殖）。
[0128] 本发明亦包括与人类CD3结合及诱导T-细胞介导的肿瘤细胞杀伤的抗体及其抗 原结合片段。例如，本发明包括抗-CD3抗体，其当以活体外T-细胞介导的肿瘤细胞杀伤分 析，例如使用文中实例6所定义的分析模式（例如在抗-CD3抗体的存在下评估U937肿瘤 细胞被人类PBMC杀伤的程度）或实质上类似的分析测量时，以低于约2. 3pM的EC5(I值诱导 T-细胞介导的肿瘤细胞杀伤。在某些实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段，当以活体 外T-细胞介导的肿瘤细胞杀伤分析，例如使用文中实例6所定义的分析模式或实质上类似 的分析测量时，以低于约2. 3pM，低于约2. 2pM，低于约2. lpM，低于约2. OpM，低于约1. 8pM， 低于约1. 6pM，低于约1. 4pM，低于约1. 2pM，低于约1. OpM，低于约0. 8pM，低于约0. 6pM，或 低于约0. 5pM的ECjt诱导T-细胞介导的肿瘤细胞杀伤（例如PBMC-介导的U937细胞杀 伤）。
[0129] 本发明包括以高亲和力与人类CD3结合的抗体及其抗原结合片段。本发明亦包括 以中或低亲和力与人类CD3结合的抗体及其抗原结合片段，依照治疗情况及所希望的特定 靶向性质。例如，在其中一臂与CD3结合而另一臂与靶抗原（例如CD20)结合的双特异性 抗原结合分子的情况中，可能希望靶抗原结合臂以高亲和力与靶抗原结合，同时抗-CD3臂 仅以中度或低亲和力与⑶3结合。以此方式，可达到抗原结合分子优先靶向表达靶抗原的 细胞，同时避免一般/非靶向的CD3结合及后续与其有关的不良副作用。
[0130] 根据某些实施方式，本发明包括，当以表面等离子共振，例如使用文中实例3所定 义的分析模式所测定，以（例如于25°C )低于约15nM的KD与人类CD3结合的抗体及抗体的 抗原结合片段。在某些实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段，如以表面等离子共振， 例如使用文中实例3所定义的分析模式（例如mAb-捕捉或抗原-捕捉模式）或实质上类 似的分析所测定，以低于约5nM，低于约2nM，低于约InM，低于约800pM，低于约600pM，低于 约500pM，低于约400pM，低于约300pM，低于约200pM，低于约180pM，低于约160pM，低于约 140pM，低于约120pM，低于约100pM，低于约80pM，低于约60pM，低于约40pM，低于约20pM或 低于约10pM的K D与⑶3结合。
[0131] 本发明亦包括，如以表面等离子共振于25°C或37°C，例如使用文中实例3所定义 的分析模式或实质上类似的分析所测定，以大于约10分钟的解离半寿期（tl/2)与CD3结 合的抗体及其抗原结合片段。在某些实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段，如以表面 等离子共振于25°C或37°C，例如使用文中实例3所定义的分析模式（例如mAb-捕捉或抗 原-捕捉模式）或实质上类似的分析所测定，以大于约20分钟，大于约30分钟，大于约40 分钟，大于约50分钟，大于约60分钟，大于约70分钟，大于约80分钟，大于约90分钟，大 于约100分钟，大于约200分钟，大于约300分钟，大于约400分钟，大于约500分钟，大于 约600分钟，大于约700分钟，大于约800分钟，大于约900分钟，大于约1000分钟，或大 于约1200分钟的tl/2与⑶3结合。
[0132] 本发明包括能同时与人类CD3和人类CD20结合的双特异性抗原结合分子（例如 双特异性抗体）。根据某些实施方式，本发明的双特异性抗原结合分子与表达CD3及/或 CD20的细胞特异性相互作用。双特异性抗原结合分子与表达CD3及/或CD20的细胞结合 的程度可通过如文中实例8所说明的荧光活化的细胞分选（FACS)来评估。例如，本发明包 括与表达⑶3但不表达⑶20的人类T细胞系（例如Jurkat)，表达⑶20但不表达⑶3的人 类B细胞系（例如Raji)及/或灵长类T-细胞（例如食蟹猴外周血液单核细胞[PBMC]) 特异性结合的双特异性抗原结合分子。本发明包括，如使用实例8中所述的FACS分析或实 质上类似分析所测定，以从约9. 0xl(T6至约2. 0xl(T9或更低的EC 5(|值与任何前述细胞和细 胞系结合的双特异性抗原结合分子。
[0133] 本发明也包括以1. OpM和lOOOnM之间的EC5Q值结合表达⑶3的人T细胞（例如 Jurkat)的抗-⑶3/抗-⑶20双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中，抗-⑶3/抗-⑶20 双特异性抗原结合分子以InM和60nM之间的ECjt结合表达⑶3的人T细胞。例如，本 发明包括以约lpM、约10pM、约100pM、约500pM、约InM、约2nM、约5nM、约10nM、约20nM、约 30nM、约 40nM、约 50nM、约 60nM、约 70nM、约 80nM、约 90nM、约 100nM、约 200nM、约 300nM、约 500nM、约800nM、约1000nM或更高的EC5Q值结合表达CD3的人T细胞（例如Jurkat)的 抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子。
[0134] 本发明亦包括表现出一或多项由下列组成的组中选出的特征的抗-⑶3/抗-⑶20 双特异性抗原结合分子：(a)于体外诱导PBMC增殖（参见，例如文中实例9) ;(b)在人 类全血中活化T-细胞，诱导IFNy释放及⑶25上调（参见，例如文中实例10) ;(c)在 抗-CD20-抗性的细胞系上诱导T-细胞介导的细胞毒性（参见，例如文中实例11) ;(d)诱 导对人类B-细胞的细胞毒性（例如Raji ;参见，例如实例13) ;(e)在用人类免疫细胞重建 的小鼠中去除B-细胞（例如CD19+B-细胞）（参见，例如文中实例14);及（f)于小鼠异种 移植物中减少B-细胞肿瘤体积（例如Raji肿瘤体积）（参见，例如实例15)。
[0135] 本发明包括能去除对象中的B细胞的抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子 (参见，例如实例16)。例如，根据某些实施方式，提供抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合 分子，其中将双特异性抗原结合分子单次施用于对象（例如以约〇. lmg/kg、约0. 08mg/kg、 约 0? 06mg/kg、约 0? 04mg/kg、约 0? 04mg/kg、约 0? 02mg/kg、约 0? 01mg/kg 或更低的剂量）， 使此对象的B细胞数目下降（例如从此对象所采集的血液样本中）至可检测水平以下。在 某些实施方式中，单次施用约0. lmg/kg剂量的抗-⑶3/抗-⑶20双特异性抗原结合分子， 在将双特异性抗原结合分子施用于此对象后约第7天、约第6天、约第5天、约第4天、约第 3天、约第2天、约第1天，使此对象的B胞数目下降至可检测水平以下。根据某些实施方 式，单次施用约〇.〇lmg/kg剂量的本发明抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，直到施 用后至少约7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天或更多天，使 B胞数目保持在可检测水平以下。如文中所用，表达法"可检测水平以下"指在从对象抽取 的血液样本中，使用标准的B细胞检测分析，例如如文中实例16中所述的B细胞标志物的 FACS分析，无法直接或间接检测到B细胞。
[0136] 在相关的实施方式，提供抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，其中在施用约 0. 01mg/kg的单次剂量的抗原结合分子至对象后约第1天至约第28天，从对象抽出的每微 升血液的B细胞数，比施用前由此对象抽出的每微升血液的B细胞数目低25%。在某些其 他的实施方式中，提供抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，其中在施用约0. 01mg/kg 的单次剂量的抗原结合分子至对象后约第1天至约第56天，从对象抽出的每微升血液的B 细胞数，比施用前由此对象抽出的每微升血液的B细胞数目低50%。
[0137] 本发明亦提供抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，当施用于对象时，其造成 不超过一次短暂的T细胞降低。例如，提供抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，当以 约0. 0 lmg/kg的剂量施用于对象时，在施用后第1天造成T细胞数目下降，但其中每微升血 液的T细胞数在之后的时间点回升（例如在施用后约第2天、第7天、第14天、第28天、第 42天、第56或之后）。例如，本发明提供抗-CD3/抗-CD20双特异性抗原结合分子，其中在 施用约0. 〇lmg/kg剂量的抗原结合分子至对象后约第14天至约第56天，从该对象抽出的 每微升血液的T细胞数目，等于或大于施用双特异性抗原结合分子之前由该对象抽出的每 微升血液的T细胞数目。
[0138] 表位作图及相关技术
[0139] 在CD3上与本发明的抗原结合分子结合的表位可由CD3蛋白的3或多个（例如3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多）氨基酸的单条连续序列所 组成。备选地，表位可由CD3的多个非连续氨基酸（或氨基酸序列）所组成。本发明的抗 体可与包含在单条⑶3链（例如⑶3-e，⑶3-S或⑶3-Y )内的氨基酸相互作用，或可与 二或多条不同CD3链上的氨基酸相互作用。术语"表位"，如文中所用，指与抗体分子可变区 中称为补位（paratope)的特异性抗原结合位置相互作用的抗原决定簇。单个抗原可具有 一个以上的表位。因此，不同的抗体可与抗原上的不同区域结合并可具有不同的生物效应。 表位可为构象或线性的。构象表位由来自线性多肽链的不同区段的空间上并列的氨基酸所 产生。线性表位由多肽链中相邻的氨基酸残基所产生。在某些情况下，表位可包括抗原上 的糖部分、磷酰基或磺酰基。
[0140] 本领域的一般技术者已知的多种技术皆可用于测定抗体的抗原结合结构域是否 与多肽或蛋白内的"一或多个氨基酸相互作用"。示例的技术包括，例如习用的交叉阻断分 析，例如描述于 Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb.，NY)中，丙氨酸扫描突变分析、肤印迹分析（Reineke (2004)，Methods Mol Biol 248: 443-463)及肽切割分析。此外，可使用例如表位切除、表位提取及抗原的化学修饰等方法 (Tomer(2000)Protein Science 9:487-496)。可用于鉴定多肽内与抗体的抗原结合结构 域相互作用的氨基酸的另一种方法为通过质谱检测的氢/氘交换。一般而言，氢/氘交换 方法包括以氘标定目标蛋白，接着让抗体与氘标定的蛋白结合。接着，将蛋白/抗体复合 物转置于水中，让除了受抗体保护的残基（其仍为氘标定）以外的所有残基发生氢-氘交 换。解离抗体后，将目标蛋白以蛋白酶裂解并以质谱分析，藉此找出氘标定的残基，其对 应于与抗体相互作用的具体氨基酸。参见，例如Ehring(1999) Analytical Biochemistry 267(2) :252-259 ;Engen 和 Smith(2001)Anal. Chem. 73:256A-265A。抗原 / 抗体复合物的 X-光晶体学亦可用于表位作图的目的。
[0141] 本发明进一步包括与文中所述的任何具体示例性抗体（例如，包括如文中表1所 述的任何氨基酸序列的抗体）结合相同的表位的抗-CD3抗体。同样的，本发明亦包括与任 何文中所述的具体示例性抗体（例如，包括如文中表1所述的任何氨基酸序列的抗体）竞 争结合⑶3的抗-⑶3抗体。
[0142] 本发明亦包括双特异性抗原结合分子，其包含特异性与人类CD3结合的第一抗原 结合结构域，及特异性与人类CD20结合的第二抗原结合结构域，其中第一抗原结合结构域 与任何文中所述的具体示例性CD3-特异性抗原结合结构域结合CD3上的相同表位，及/或 其中第二抗原结合结构域与任何文中所述的具体示例性CD20-特异性抗原结合结构域结 合⑶20上的相同表位。
[0143] 同样的，本发明亦包括双特异性抗原结合分子，其包含特异性与人类CD3结合的 第一抗原结合结构域，及特异性与人类CD20结合的第二抗原结合结构域，其中第一抗原结 合结构域与任何文中所述的具体示例性CD3-特异性抗原结合结构域竞争结合CD3,及/或 其中第二抗原结合结构域与任何文中所述的具体示例性CD20-特异性抗原结合结构域竞 争结合⑶20。
[0144] 通过使用本领域中已知的习用方法，可容易地测定特定的抗原结合分子（例如抗 体）或其抗原结合结构域是否与本发明的参照抗原结合分子结合相同的表位，或竞争结 合相同的表位。例如，为了测定测试抗体是否与本发明参照双特异性抗原结合分子结合 CD3 (或CD20)上相同的表位，首先允许参照双特异性分子与CD3蛋白（或CD20蛋白）结 合。接着，评估测试抗体与CD3 (或CD20)分子结合的能力。若测试抗体在与参照双特异性 抗原结合分子饱和结合后，能与CD3 (或CD20)结合，则可以得出结论，该测试抗体与参照双 特异性抗原结合分子结合CD3(或CD20)的不同表位。另一方面，若测试抗体在与参照的双 特异性抗原结合分子饱和结合后，不能与CD3 (或CD20)分子结合，则测试抗体可能与和本 发明的参照双特异性抗原结合分子结合的表位相同的CD3(或CD20)表位结合。然后可进 行另外的常规实验（例如肽突变和结合分析），以确定所观察到的缺乏测试抗体结合事实 上是否由于与参照双特异性抗原结合分子结合相同的表位所致，或是否是立体阻断（或另 外的现象）造成缺乏观察到的结合。此类实验可使用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞仪或 本领域中可取得的另外其他定量或定性抗体-结合测定法来进行。依照本发明某些实施方 式，如在竞争性结合测定法中所测，若例如1-、5-、10-、20_或100-倍过量的一种抗原结合 蛋白抑制另一抗原结合蛋白的结合至少50 %，但优选地75 %、90 %或甚至99 %，则二种抗 原结合蛋白结合相同（或重迭）的表位（参见，例如Junghans等人，Cancer Res. 1990 50 : 1495-1502)。备选地，若基本上降低或消除一种抗原结合蛋白的结合的抗原中所有的氨基 酸突变，降低或消除另一种抗原结合蛋白的结合，则二种抗原结合蛋白被认为与相同的表 位结合。若降低或消除一种抗原结合蛋白的结合的仅一亚群的氨基酸突变降低或消除另一 种抗原结合蛋白的结合，则二种抗原结合蛋白被认为具有"重迭的表位"。
[0145] 为了测定抗体或其抗原结合结构域是否与参照抗原结合分子竞争结合，以二个取 向进行上述结合方法：在第一取向中，允许参照抗原结合分子在饱和的条件下与CD3蛋白 (或CD20蛋白）结合，接着评估测试抗体与CD3(或CD20)分子的结合。在第二取向中， 允许测试抗体在饱和的条件下与CD3 (或CD20)分子结合，接着评估参照抗原结合分子与 CD3(或CD20)分子的结合。若在二个取向中，仅有第一（饱和）抗原结合分子能与CD3(或 CD20)分子结合，则得出结论测试抗体和参照抗原结合分子竞争结合CD3(或CD20)。本领 域的一般技术者应了解，与参照抗原结合分子竞争结合的抗体可能不一定与参照抗体结合 相同的表位，但可能通过与重迭或相邻的表位结合，在立体上阻断参照抗体的结合。
[0146] 制备抗原结合结构域及构建双特异性分子
[0147] 对特定抗原特异性的抗原结合结构域可通过任何本领域中已知的抗体生产技术 来制备。一旦获得后，使用习用方法，对二种不同抗原（例如CD3和CD20)特异性的二种不 同的抗原结合结构域可以相对彼此适合地排列，以产生本发明的双特异性抗原结合分子。 (可用于构建本发明双特异性抗原结合分子的示例的双特异性抗体模式的论述提供于文中 他处）。在某些实施方式中，本发明的多特异性抗原结合分子的一或多个个别组份（例如 重链和轻链）衍生自嵌合、人源化或全人类抗体。制造此等抗体的方法已为本领域所熟知。 例如，可使用VELOCIMMUNE?技术制备本发明的双特异性抗原结合分子的一或多条重链及/ 或轻链。使用VELOCIMMUNE?技术（或任何其他人类抗体产生技术），起初先分离具有人类 可变区和小鼠恒定区的对特定抗原（例如CD3或CD20)高亲和力的嵌合抗体。表征并就所 希望的性质，包括亲和力、选择性、表位等选择抗体。以所希望的人类恒定区置换小鼠恒定 区以产生全人类重链及/或轻链，所述重链及/或轻链可并入本发明的双特异性抗原结合 分子中。
[0148] 基因改造的动物可用于制造人类双特异性抗原结合分子。例如，可使用不能重排 和表达内生性小鼠免疫球蛋白轻链可变序列的基因改造的小鼠，其中小鼠仅表达一或二个 人类轻链可变结构域，所述人类轻