me验证表达量结果，同样显示供氮强烈诱 导。
[0021] 图5.是启动子Y8A下游基因用realtime验证水稻品种中花11中的表达量的结 果。
[0022] 图6.是本发明的实施例中另外选择的3个常规水稻品种中的Y8A下游基因表达 模式的Realtime验证结果。
[0023] 图7.启动子Y8A融合GUS稳定转化水稻后，各个截短模式的不同阳性单株中GUS 基因表达量随供氮前后的变化。其中：图7a、图7b从左至右依次为启动子全长Y8A及启动 子截短区段Y8B的表达量检测结果，line后面的不同数字编号代表不同的水稻转基因阳性 株系。
【具体实施方式】
[0024] 以下实施例进一步定义本发明，并描述了启动子Y8A及其截短片段Y8B调苄基因 表达的模式、遗传转化、以及表达水平和GUS活性的测定方法和该启动子在水稻中的调控 表达的模式。根据以下的描述和这些实施事例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特 征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其 适用各种用途和条件。
[0025] 下面结合附图对本发明作进一步具体描述。
[0026] 实施例1 :Y8基因启动子的调控模式的确定和序列的获得
[0027] 为发掘水稻中缺氮或供氮高倍诱导基因表达的启动子，为基因工程改良水稻氮素 吸收提供新的启动子材料，申请人设计了图1中的技术路线，并选用了两种公知公用的常 规水稻品种作为实验材料：即日本晴和珍汕97。应用芯片技术，挑选对氮胁迫有明显反应 的新基因，该技术可用于定量检测大量基因在不同时间表达水平(杨蓉等，1999)。
[0028] 将日本晴和珍汕97的种子37°C浸种3天，催芽2天，沙培一周出苗，移苗于水 稻全营养液水培(水培营养液成分：1. 44mMNH4N03, 0. 3mMNaH2P04, 0. 5mMK2S04, 1.OmM CaCl2, 1. 6mMMgS04, 0. 17mMNaSi03, 50uMFe-EDTA, 0. 06uM(NH4) 6M〇7024, 15uMH3B03, 8uM 皿11(：12,0.1211]\1(：11504,0.1211]\^1150 4,29 11]\1卩6(：13,40.511]\1(^钍1。3(^(1，口11值5.5，具体 参见Yoshidaetal.，1976)，培养至5叶期，将部分水稻苗移至缺氮的营养液(上述营养液 中不加NH4N03即可)中进行氮胁迫处理，以继续用全营养液培养的苗做为对照。根据实验需 要，处理时间点设计如下：缺氮lh、缺氮Id、缺氮3d、缺氮7d、缺氮7d后恢复供氮2h、恢复 供氮Id。取样时地上部和根部分开，分别用锡箔纸包好，置于液氮中保存。抽提样品RNA并 反转录成cDNA(具体步骤参见invitrogen公司的SSIII反转录试剂盒说明书，货号：Cat. No. 18080-093)，将各个时间点的样品送至北京博奥生物有限公司制作全基因组cDNA芯片 (杨蓉等，1999)，对反馈的芯片数据进行分析，从芯片结果中发现，由启动子Y8A启动的下游 基因在这两个品种中缺氮7d后恢复供氮2h根部有高倍诱导，而地上部则无此反应(见图4 中a、图4中b)。为了确信该基因对氮的反应，申请人用中花11种了一批胁迫材料，验证 这些基因对氮的反应。Realtime验证结果（RealtimePCR的方法参见TAKARA商业试剂盒 的使用说明书，货号code:DRR041A)显示：在中花11的根中，缺氮7d后恢复供氮2h诱导 Y8A下游基因上调表达约20倍，随着继续供氮，表达量逐渐回复到正常水平(见图5)。为进 一步验证该基因是否在不同品种中拥有类似的表达模式，申请人又用另外3个水稻品种华 粳295、9311和MH63中种了一批胁迫材料(其中华粳295为一个公知公用的水稻粳稻品种， 9311和MH63为公知公用的籼稻品种)，结果与中花11结果类似(见图6)。申请人将该基因 序列输入RGAP网站（//rice,plantbiology.msu.edu/)进行Blast得到该基因的全基因序 列及登录号L0C_0s09g30490。在softberry网站上，预测全长0RF，从而得到Y8A下游基因 的全长基因组序列及启动子序列。该基因位于水稻9号染色体，全长基因组序列为750bp， 全长cDNA为414bp，编码137个氨基酸(见序列表SEQIDN0:3)。申请人取该基因ATG上 游1936bp为该基因的启动子全长（即Y8A，见序列表SEQIDN0 :1)。
[0029] 实施例2 :启动子表达转化载体的构建
[0030] 本发明是通过PCR方法，以水稻品种中花11的总DNA为模板，扩增得到了Y8A启 动子全长的序列，为便于应用并且缩小该启动子对氮反应调控元件的范围，申请人又同时 将该启动子全长序列按5'端截短模式截短至ATG上游982bp，命名为：Y8B(见序列表SEQ IDN0:1)，并用PCR的方法得到截短的片段。具体如下：根据已知启动子Y8A全长序列 (1936bp，见序列表SEQIDN0:1)及其截短的启动子区段Y8B(见序列表SEQIDN0:2)，设 计两对引物对(引物对的序列见表1)，以水稻品种中花11的总DNA为模板，扩增分别得到启 动子Y8A全长序列（1936bp)及截短的Y8B(982bp)。扩增Y8A及Y8B时，在两对引物的5' 端均添加了相同的限制性内切酶位点BamHI(引物对的序列见表1-1)，因此扩增得到的片段 可以用限制性核酸内切酶BamHI进行酶切，然后将酶切得到的Y8A和Y8B的片段分别连接 到启动子载体DX2181b上(载体DX2181b是申请人所在作物遗传国家重点实验室研究人员 在商业载体PCAMBIA1381，一个来自澳大利亚公开报道和使用的质粒的基础上改造得到的。 该载体包含有潮霉素的筛选基因：hygromycin(R)，载体DX2181b的结构参见图2所述)，这 两个载体构建的基本示意图见图3所示（图3a和图3b分别对应Y8A和Y8B融合DX2181b的构建)，我们将构建的载体分别命名为DX2181b-Y8A和DX2181b-Y8B。然后再用表1-2所 示的引物对对得到的克隆进行测序，确定启动子Y8A及Y8B均按正确的方向连接到DX218lb 载体上(见图3所示)。
[0031] 利用经典的农杆菌介导的转化方法(农杆菌EHA105,来自澳大利亚CAMBIA实验 室，转化的具体操作方法参见Elizabethet.al.，1993)，在水稻品种中花11中用Y8A及 其截短启动子启动GUS基因的表达。考察转基因阳性植株，发现缺氮7d后供氮处理会导致 ⑶S表达量显著上升。
[0032] 表1-1本发明设计的PCR引物对
【主权项】
1. 一种在水稻缺氮后恢复供氮下特异性诱导表达的启动子Y8A，其核苷酸序列如序列 表SEQIDNO:1 所示。
2. -种在水稻供氮情况下特异性诱导基因表达的启动子Y8A，它还包括截短的启动子 区段Y8B，该启动子区段Y8B的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:2所示。
3. 权利要求1所述的启动子Y8A在缺氮后恢复供氮下诱导基因在水稻中表达的应用。
4. 权利要求2所述的启动子Y8A的截短的启动子区段Y8B在缺氮后恢复供氮下诱导基 因在水稻中表达的应用。
【专利摘要】本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种水稻缺氮后恢复供氮特异性诱导表达启动子Y8A及应用。利用芯片技术，得到了启动子Y8A下游基因供氮诱导表达的信息，通过不同水稻品种验证了Y8A下游基因供氮诱导的表达模式。通过PCR方法，扩增出启动子Y8A全长及其5`端截短的片段Y8B，连接到载体DX2181b上，构建得到启动子融合GUS表达的载体。再将构建好的载体转化水稻品种中花11，在转化阳性植株中验证该启动子对GUS基因表达的调控，通过Realtime表达量验证，进一步确证Y8A及Y8B属于缺氮后恢复供氮特异性诱导表达的启动子，其功能区段在ATG上游982bp。本发明为水稻提供了新的启动子资源。
【IPC分类】C12N15-82, C12N15-113, A01H5-00
【公开号】CN104711260
【申请号】CN201310684154
【发明人】练兴明, 杨猛, 张星
【申请人】华中农业大学
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2013年12月13日