偶合试剂三光气、与肼树脂摩尔质量比为(2-6):1的第一个带Fmoc保护基的氨基酸或氨基酸片段，将上述氨基酸或氨基酸片段去除保护基团Fmoc后，与三光气溶于DIEA中，加入固相反应柱,于室温下反应0.5-5小时。所述偶联反应时间可以根据实际情况进行调节，如以茚三酮法监测反应终点，直至树脂呈无色时终止反应。采用同样的方法依次偶联环孢菌素的氨基酸或氨基酸片段，直至获得线性 H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-餅树脂。
[0032]上述步骤S03 中，将所述 H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-肼树脂进行氧化活化处理的过程中，所述氧化活化处理的试剂为NBS的有机溶液，所述氧化活化处理方法为:先采用NBS氧化l-30min后，再用有机溶剂进行闭环切割处理12-96h。作为优选实施例，所述有机溶剂为DCM、DMF中的至少一种，为了提高氧化活化处理效果，作为优选实施例，所述有机溶剂为DCM。
[0033]本发明实施例中，由于多肽固相合成的载体树脂为肼树脂，因此，在进行上述裂解切割的同时，一方面，肼树脂经过切割处理能从肽链中脱落，另一方面，脱落肼树脂后的线性肽能在上述氧化活化体系将多肽两端游离的氨基和羧基首尾相连形成环肽、实现自动闭环，从而得到环孢菌素。这样，经过上述处理，能够一步实现切割和闭环反应，简化了操作程序，同时避免了液相缩合成环过程中的多聚缩合副反应。
[0034]本发明实施例中，还可对合成得到的环孢菌素进行纯化、冻干处理，从而得到纯度高、适于保存的环孢菌素粉针剂。作为优选实施例，为了获得纯度高、收率高的环孢菌素样品，所述纯化采用高效液相色谱法纯化。所述高效液相色谱法不受限制。作为进一步优选实施例，为了进一步提高纯化效率，所述纯化采用反相高效液相色谱法纯化，所述反相高效液相色谱法的色谱柱可采用常用的色谱柱，如C18柱、氨基柱、氰基柱等。
[0035]本发明实施例提供的环孢菌素的合成方法，采用三光气(BTC)作为新型多肽合成缩合试剂，首次开发了以固相多肽合成技术合成环孢菌素全序列的新工艺。本发明实施例中，所述三光气能够在室温下将氨基酸的羧基直接转变为高活性的酰氯，因而能够在非常温和的条件下将氨基和羧基缩合成酰胺键，进一步使固相合成环孢菌素全序列成为可能。
[0036]其次，本发明以肼树脂作为固相合成载体树脂，可以在固相合成结束时直接将多肽的氨基和羧基端首尾相连而形成环肽，避免了液相缩合成环过程中的多聚缩合副反应，提高了环孢菌素的纯度和产率。
[0037]本工艺合成条件温和，只需要一种多肽合成缩合试剂就可在室温下以固相多肽合成技术合成环孢菌素全序列，且副产物少，合成步骤简单，是快速和经济地构建环孢菌素药物筛选化合物库、以及大规模生产环孢菌素的有效途径。
[0038]此外，本发明实施例通过选用合适替代度的肼树脂，在提高环孢菌素纯度的同时，节约了生产成本；且采用高效液相色谱法进行多孢菌素的纯化，提高了纯化效率和收率。
[0039]下面结合具体实施例进行说明。
[0040]实施例1 一种环孢菌素的合成方法
[0041]环孢菌素的合成:称量200毫克2，2，4，6，7_五甲基苯并呋喃(Fmoc)保护的肼树月旨(Hydrazine Resin 0.15mmol/g)于手动固相多肽合成器中。依次用Fmoc保护的D-Ala,MeLeu, Meleu, MeVal, MeBmt, Abu, MeGly, MeLeu, Val, Meleu, Ala 为基本氨基酸合成原料，以三光气(BCT)为多肽缩合剂，按照标准Fmoc策略合成化合物。用N-溴代丁二酰亚胺(NBS)氧化切割得到粗产物，经制备高效液相色谱纯化后冻干得到纯产物，总收率为18%。
[0042]实施例1的固相合成环孢菌素A的工艺流程图如图2所示。
[0043]实施例2 —种环孢菌素的合成方法
[0044]环孢菌素的合成:称量200毫克2，2，4，6，7_五甲基苯并呋喃(Fmoc)保护的肼树月旨(Hydrazine Resin 0.45mmol/g)于手动固相多肽合成器中。依次以Fmoc保护的D-Ala,MeLeu, Meleu, MeVal, MeBmt, Abu, MeGly, MeLeu, Val, Meleu, Ala 为基本氨基酸片段合成原料，以三光气(BCT)为多肽缩合剂，按照标准Fmoc策略合成化合物。用N-溴代丁二酰亚胺(NBS)氧化5分钟之后，室温下加入DCM切割72小时得到粗产物，经制备高效液相色谱纯化后冻干得到纯产物，总收率为17%。
[0045]实施例3 —种环孢菌素的合成方法
[0046]环孢菌素的合成:称量200毫克2，2，4，6，7_五甲基苯并呋喃(Fmoc)保护的肼树月旨(Hydrazine Resin 0.8mmol/g)于手动固相多肽合成器中。依次Fmoc保护的D-Ala,MeLeu, Meleu, MeVal, MeBmt, Abu, MeGly, MeLeu, Val, Meleu, Ala 为基本氨基酸合成原料，以三光气(BCT)为多肽缩合剂，按照标准Fmoc策略合成化合物。用N-溴代丁二酰亚胺(NBS)氧化7分钟之后，室温下加入DCM切割48小时得到粗产物，经制备高效液相色谱纯化后冻干得到纯产物，总收率为12%。
[0047]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种环孢菌素的合成方法，包括以下步骤: 提供Fmoc基团保护的肼树脂； 采用三光气作为缩合试剂，固相合成H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-餅树脂； 将所述 H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-餅树脂进行氧化活化处理，得到环孢菌素。
2.如权利要求1所述的环孢菌素的合成方法，其特征在于，所述固相合成H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-餅树脂的步骤中，在所述Fmoc基团保护的肼树脂上采用逐一偶联的方式依次偶联Fmoc基团保护的D_Ala、MeLeu,Meleu、MeVal、MeBmt> Abu> MeGly、MeLeu> Val、Meleu、Ala。
3.如权利要求1所述的环孢菌素的合成方法，其特征在于，所述固相合成H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-餅树脂的步骤中，在所述Fmoc基团保护的肼树脂上依次偶联Fmoc保护的氨基酸片段。
4.如权利要求1?3任一所述的环孢菌素的合成方法，其特征在于，所述氧化活化处理方法为:先采用NBS氧化l-30min后，再用有机溶剂进行闭环切割处理12_96h。
5.如权利要求1?3任一所述的环孢菌素的合成方法，其特征在于，所述肼树脂的替代度为 0.2 ?1.0mmol/go
6.如权利要求1?3任一所述的环孢菌素的合成方法，其特征在于，所述Fmoc保护基团的去除试剂为含体积分数为20%的哌啶的DMF。
7.如权利要求4所述的环孢菌素的合成方法，其特征在于，所述有机溶剂为DCM、DMF中的至少一种。
8.如权利要求1?3任一所述的环孢菌素的合成方法，其特征在于，还包括将合成得到的环孢菌素进行纯化、冻干处理。
9.如权利要求8任一所述的环孢菌素的合成方法，其特征在于，所述纯化采用高效液相色谱法纯化。
10.如权利要求1?3任一所述的环孢菌素的合成方法，其特征在于，所述纯化采用反相高效液相色谱法纯化。
【专利摘要】本发明适用于药物合成技术领域，提供了一种环孢菌素的合成方法。该方法包括下述步骤：提供Fmoc基团保护的肼树脂；采用三光气作为缩合试剂，固相合成H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-肼树脂；将所述H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-肼树脂进行氧化活化处理，得到环孢菌素。采用该方法合成环孢菌素，合成条件温和，且工艺简单，可实现产业化生产。
【IPC分类】C07K1-04, C07K1-06, C07K7-64
【公开号】CN104744570
【申请号】CN201310754510
【发明人】粟武, 房丽晶, 武春雷
【申请人】深圳先进技术研究院
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2013年12月31日
【公告号】WO2015101176A1