列SEQIDNO. 2,W及 包含重组质粒的宿主细胞。同时，本发明包括构建该重组质粒和宿主细胞的方法，W及用重 组工程生产亮氨酸脱氨酶的方法。
[0029] 本发明进一步地提供了一种亮氨酸脱氨酶，具有SEQIDNO. 1氨基酸序列。
[0030] 在本发明中，"亮氨酸脱氨酶"是指具有亮氨酸脱氨酶活性的SEQIDNO. 1序列的 多肤。该术语还包括SEQIDNO. 1序列的变异体，包括(但不限于)若干个氨基酸的缺失，插 入和/或取代，W及在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，也可W使不影响序列的 修饰形式上的差异。
[0031] 本发明的亮氨酸脱氨酶酶基因全长序列或其片段通常可W用PCR扩增法，重组 法，或人工合成法获得。
[0032] 本发明中，可选用本领域己知的各种载体，如质粒，粘粒，瞻菌体及反转录病毒等。
[0033] 重组表达载体可W用本领域熟知的方法导入宿主细胞中，该些方法包括；氯化巧 热激法，电转化法，PEG介导法，基因枪法等。
[0034] 本发明中，术语"宿主细胞"包括原核细胞和真核细胞。常用的原核细胞如大肠杆 菌，乳酸乳球菌等。常用的真核细胞如酵母细胞，或各种动植物细胞。
[0035] 本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域 的传统技术。另外，除非另有说明，在本文中，核酸W5'至3'的方向从左向右书写，氨基酸 序列则W氨基端到駿基端的方向从左向右书写。
[0036] 下面结合实验室具体的实验数据进一步阐述本发明。应理解，该些实施例仅用于 说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常 按照常规条件操作，例如《分子克隆实验指南》，或者制造厂商所建议的条件。
[0037] 实施例1;含有亮氨酸脱氨酶基因序列的重组质粒祀T2化-LeuDH的构建 利用美国国家生物技术信息中屯、（NCBI)的数据库，分析、筛选、发现Laceyella sacchari中有一段序列与亮氨酸脱氨酶基因序列相似度较高，很有可能是编码亮氨酸脱氨 酶的基因序列，对此序列进行筛选、优化(优化包括部分位点的突变、插入等)，得到具有SEQ IDNO. 2的核巧酸序列。
[0038]Ls-LeuDH基因由金斯瑞公司按照SEQIDNO.2核巧酸序列进行人工合成。在 序列两端分别添加NdeI(CAT)与化0I(CTCGAG)，连接至祀T2化质粒载体上的NdeI 与化0I酶切位点之间。得到重组质粒祀T2化-LeuDH，转入50微升大肠杆菌感受态细 胞化21 (DE3)，在冰中缓慢混匀，静置冰浴30分钟，迅速转入42摄氏度水浴热击60秒， 再在冰上放置3分钟，加入1毫升LB培养基（1%氯化钢，1%蛋白腺，0. 5%酵母粉)，37摄 氏度下摇床培养2小时，转速180转。之后在还有终浓度lOOmg/mL氨节的LB固体平板 上划线，37摄氏度静置过夜培养，20小时后对单菌落进行per鉴定，上游引物设计为：5' 〉CATATGAAAATCTTTGAATAC< 3'。下游引物设计为；5'〉CTCGAGGCGGTGGGA< 3'。
[0039] 重组质粒祀T2化-LeuDH的per鉴定电泳验证电泳结果（图2)表明，单克隆菌落 含有目的基因片段，可用于后续的亮氨酸脱氨酶蛋白的诱导表达。
[0040] 实施例2;重组亮氨酸脱氨酶的表达和纯化 挑取单菌落的工程菌E.coli化21-pET22b-LeuDH，于10ml含lOOyg/mL氨节亲霉素 的LB液体培养基中37°C振荡培养10小时；按Iv/v%的接种量吸取培养液转接到含100yg/ mL氨节青霉素的自诱导液体培养基中30°C进行培养（自诱导培养基配方为(每100毫升）； 蛋白腺1.5克，酵母粉2. 5克，氯化钢1克，葡萄糖0.2克，乳糖0.3克。），待ODewJi到1.0后 25°C低温培养20小时，离屯、收集菌液，弃上清培养基，用抑=8的PBS缓冲等体积洗漆S次， 加入PBS缓冲使得重悬菌液ODweJi到20,混匀；用超声破碎仪破碎，超声工作条件；工作 时间设为15min，每次工作3s，休息3s，功率设定220w，破碎后1000化pm离屯、lOmin取上清 粗酶液；粗酶液用0. 22ym膜过滤除去杂质。将收集到的蛋白（50yL)与1XSDS-PAGE样品 缓冲液，按1:1体积比于沸水中煮沸5min失活，12000巧m离屯、Imin，上清加入12%SDS-PAGE 胶中进行电泳验证。用含有质粒祀T2化的E.coliBL21值E3)诱导表达出的蛋白作为空 白对照，验证结果如图3所示。对获得的含有亮氨酸脱氨酶的粗酶液用0. 22ym膜过滤 除去杂质，采用亲和介质填充层析柱镶柱对重组蛋白进行纯化，粗酶液经镶柱亲和层析时， 加入酶液后在37°C摇床65巧m下15min充分结合，再用WashBuffer洗去杂蛋白后，再用ElutionBuffer将目的蛋白分批次洗脱下来，洗脱之前每批次在37°C摇床6虹pm下15min 充分后洗脱。W8mL为单位分管收集合并。目的蛋白保存于4°C，并进行SDS-PAGE电泳检 测纯化效果。在40~42kDa处的蛋白质条带即为亮氨酸脱氨酶，如图3所示。
[0041] 实施例3;亮氨酸脱氨酶酶活测定。
[0042] 按照表1中所示的反应体系加入各组分，对照采用含有质粒祀T2化大肠杆菌表达 产物。基本原理是鉴于NADH在340nm处有最大吸收峰，通过光吸收峰值的改变定量测定酶 的含量。比色皿中依次加入 反应液 1. 95ml;pH10. 0 的NasCOs/Na肥〇3缓冲液，含lOmMk亮氨酸，3. 5mMNAD+。置 于分光光度计样品槽中，检测原始NADH吸光值，待读数稳定后马上加入50yL的稀释适当 倍数酶液，开始光度计读数，每Is测定一次吸光值，共30s，反应结束后得到A3??/min值。 酶的活力单位采用国际单位IU，即每分钟氧化1ymol的NADH所用的酶量为1个酶活力单 位。
[0043] 表1亮氨酸脱氨酶活性检测
【主权项】
1. 一种亮氨酸脱氢酶，其氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。
2. 编码权利要求1所述亮氨酸脱氢酶的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示。
3. -种表达载体，它包含权利要求2所述的亮氨酸脱氢酶基因。
4. 一种重组菌，其是通过利用权利要求3所述的表达载体转化宿主细胞获得的。
5. 亮氨酸脱氢酶的制备方法，其特征在于，在营养培养基中培养权利要求4所述的重 组菌，收集具有亮氨酸脱氢酶活性的多肽。
6. 根据权利要求5所述的亮氨酸脱氢酶的制备方法，其特征在于：所述的重组菌的构 建方法为：将亮氨酸脱氢酶基因连接到表达质粒载体pET22b上，得到包含亮氨酸脱氢酶基 因的重组质粒pET22b-LeuDH，然后将重组质粒pET22b-LeuDH转化到大肠杆菌BL21 (DE3) 中，得到重组菌E.coliBL21-pET22b-LeuDH。
7. 根据权利要求6所述的亮氨酸脱氢酶的制备方法，其特征在于：将重组菌E.coli BL21-pET22b-LeuDH在含100yg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中37°C振荡培养10小时； 按1% (v/v)的接种量吸取培养液转接到含100Ug/mL氨苄青霉素的自诱导液体培养基中 30°C进行培养；待OD6tltlmi达到I. 0后25°C低温培养6~12小时，离心收集菌液，弃上清培养 基，用pH=8的PBS缓冲等体积洗涤三次，加入PBS缓冲使得重悬菌液OD6tltlmi达到20,混匀； 用超声破碎仪破碎，1000 Orpm离心IOmin取上清粗酶液；粗酶液用0. 22ym膜过滤除去杂 质，再采用亲和的介质填充层析柱镍柱对重组蛋白进行纯化，得到亮氨酸脱氢酶。
8. 根据权利要求6所述的亮氨酸脱氢酶的制备方法，其特征在于：制备得到的亮氨 酸脱氢酶，在25°C，pHIO条件下比酶活为182. 62U/mg;在60°C，pHIO条件下比酶活为 326.63U/mg〇
9. 根据权利要求6所述的亮氨酸脱氢酶的制备方法，其特征在于：所述自诱导培养基 配方为：蛋白胨15g/L，酵母粉25g/L，氯化钠10g/L，葡萄糖2g/L，乳糖3g/L。
10. 权利要求1所述的亮氨酸脱氢酶在制备L型氨基酸中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种亮氨酸脱氢酶及其制备方法和应用，以Laceyella sacchari 基因组为基础，克隆出其亮氨酸脱氢酶基因LeuDH，编码亮氨酸脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了编码该亮氨酸脱氢酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供了与目前已知的亮氨酸脱氢酶来源不同的一种新型脱氢酶。该亮氨酸脱氢酶其耐热性质较好，pH适应范围较广，在工业生产中能够有效延长半衰期，降低生产成本。
【IPC分类】C12P13-04, C12N15-53, C12N9-06, C12N1-21, C12N15-70
【公开号】CN104774813
【申请号】CN201510187159
【发明人】贾红华, 韦萍, 朱文骏
【申请人】南京工业大学
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月20日