检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的引物与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子育种领域，确切地说，涉及一种检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草 剂基因BnALS3R的引物与应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着我国工业化和城市化进程加快，农村劳动力大量向城镇转移，轻简 化、机械化已成为油菜产业发展的主要方向。有效治理田间杂草是实现油菜轻简化、机械 化的重要技术环节。化学除草是当前农田控制杂草的主要手段。然而，当前油菜生产上应 用的除草剂仅能有效防治单子叶杂草，对大多数双子叶类的阔叶杂草缺少安全、高效的除 草剂进行防除，油菜生产化学除草面积非常有限。而磺酰脲类除草剂能高效防除双子叶类 阔叶杂草，具有低用量、对环境友好等特点，在我国水稻、小麦、玉米等单子叶作物中广泛应 用。遗憾的是，油菜为双子叶作物，对磺酰脲类除草剂表现敏感，生产上还未开发出对油菜 安全、高效的磺酰脲类除草剂，创制对磺酰脲类除草剂具有选择抗性的油菜新种质，拓宽现 有磺酰脲类除草剂的应用范围，是解决油菜田杂草防除的一个经济有效途径。
[0003] 磺酰脲类除草剂是一类高效、低毒的除草剂，属于乙酰乳酸合酶（acetolactate synthase，ALS ;EC4. 1. 3. 18)抑制剂类除草剂，其作用靶标为植物体内的ALS。 ALS 也叫乙酰羟基酸合酶（acetohydroxyacid synthase，AHAS ;EC2. 2. 1. 6)，是 植物和微生物3种支链氨基酸生物合成过程中的关键酶（McCourt JA, Duggleby RG. AminoAcids，2006, 31:173 - 210)。该酶负责催化两个平行反应，催化两分子丙酮酸缩 合形成2-乙酰乳酸放出C02，最终生成缬氨酸和亮氨酸，催化一分子丙酮酸和一分子2-氧 丁酸缩合形成乙酰羟基丁酸，最终生成异亮氨酸（Ronald G D，et al.，PlantPhysiolBi och，2008, 46:309-324)。如果此酶的活力受到抑制或者丧失，会导致植物缬氨酸、亮氨酸 和异亮氨酸合成受阻，影响蛋白质合成，最终导致植物生长受阻、直至死亡。磺酰脲类除 草剂作用机理是除草剂通过与ALS形成复合物阻断底物进入酶活性位点通路，抑制ALS 活性，导致支链氨基酸合成受阻，使植物组织失绿、黄化，最后逐渐死亡（McCourt JA，et al. , PNAS, 2006, 103:569-573) 〇
[0004] 随着研宄的不断深入，人们发现某些特定氨基酸残基突变能引起ALS对磺酰脲 类除草剂产生抗性，其中常见易发生变异的氨基酸残基是Pr〇197、Ala205和Trp574(参 照拟南芥 ALS 位置；Walter K L，et al.，Pest ManagSci, 2014, 70 (12): 1831-1839; Ghio C，et al.，TheorAppl Genet, 2013, 126(12) :2957-2968;胡茂龙等，中国农业科学， 2012,45(20):4326-4334)。例如，在中国甜菜的sur和莴苣的1个突变体中197位脯氨酸 被组氨酸或丝氨酸所取代；向日葵的Two突变体中205位丙氨酸被缬氨酸所取代；玉米的 XA17 中 574 位色氨酸被亮氨酸所取代（Tan S, et al.，PestManagSci, 2005, 61:246-257)。 通过进一步研宄发现，当拟南芥ALS与磺酰脲类除草剂相互作用时，除草剂结合在拟南 芥ALS催化位点的活性空腔里，当活性空腔内的氨基酸残基发生突变时，会引起除草 剂与ALS结合方式的变化，导致植物产生对磺酰脲类除草剂的抗性（Lee H，et al.，PN AS, 2011, 108(21) :8909-8913) 〇
[0005] 2013年，利用EMS诱变和定向选育技术，我们获得了甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草 剂突变体M342(公知公用，浦惠明等，专利申请号201310054645. 9)。在苯磺隆除草剂杂草 防治的推荐使用浓度下，抗性突变体M342喷药后无任何药害症状，仍能正常生长。进一步 通过分子生物学技术克隆获得了抗性突变体M342抗性基因BnALS3R(胡茂龙等，一种甘蓝 型油菜抗磺酰脲类除草剂基因及其应用；中国专利ZL201310111739.5)。抗性基因的发现 为我国抗磺酰脲类除草剂油菜品种的培育提供了自主知识产权的种质资源。利用该抗性种 质资源，常规育种方法是将含BnALS3R基因的M342与生产上推广的主栽品种进行杂交和回 交，然后在每个分离后代中喷施除草剂进行鉴定，最终选择含抗磺酰脲基因BnALS3R的抗 性单株。在每个分离后代除草剂鉴定过程中，如果除草剂剂量使用不当或喷施不均匀极易 导致误选。另外，有时在抗除草剂基因研宄过程中需要保存不抗的材料，用作比较研宄。为 此，若能根据该基因BnALS3R的突变位点特性，开发出检测抗性基因的功能性标记，从而进 行标记辅助选择，区分出育种材料中抗性基因的不同基因型，则可指导田间选育，加快育种 进程，为标记辅助选择进行油菜抗除草剂新品种选育提供选择方法和技术支撑。
【发明内容】
[0006] 技术问题
[0007] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除 草剂基因BnALS3R的分子标记引物。
[0008] 本发明的另一个目的在于提供所述检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因 BnALS3R分子标记引物的应用方法。
[0009] 技术方案
[0010] 本发明的目的是通过如下技术方案实现：
[0011] 一种检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的分子标记引物，其核甘酸 序列为：
[0012] SEQ ID NO. 1 :5'-GTTTGCGAGCAGGGCTAAGA-3'
[0013] SEQ ID NO. 2 :5'-GACATCCAACAGGTACGGTCCA-3'
[0014] 所述的分子标记引物用于检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的方 法，其特征在于，包括以下步骤：
[0015] 以待测甘蓝型油菜总DNA为模板，用权利要求1所述引物的核甘酸序列SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2进行PCR扩增；将PCR扩增的产物用限制性核酸内切酶BsrDI消化； 将消化的酶切产物经凝胶电泳检测：
[0016] 如果电泳检测表明的酶切产物含有分子量为766bp -种条带时，则为含抗磺酰脲 类除草剂基因BnALS3R的纯合型抗性油菜；
[0017] 如果电泳检测表明的酶切产物含有分子量为766bp、570bp和196bp三种条带时， 则为含抗性基因BnALS3R杂合型抗性油菜；
[0018] 如果电泳检测表明的酶切产物含有分子量为570bp、196bp两种条带时，则为不含 抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的纯合型敏感性油菜。
[0019] 所述的分子标记引物在辅助选择选育抗除草剂甘蓝型油菜品种中的应用。
[0020] 所述的应用，其特征在于，用所述引物的核甘酸序列SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2 对以恢复系为母本、以含甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的品种为父本进行 杂交的F1单株自交获得的F2群体中的植株进行抗性基因PCR扩增检测，将含有分子量 为766bp条带的可育单株套袋自交，自交后代即为获得的含有抗磺酰脲类除草剂基因 BnALS3R纯合型的含甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的F3种子；在含有分子量 为766bp条带的可育单株套袋自交后代中选择可育的单株套袋自交，自交后代即育出抗磺 酰脲类除草剂的MI CMS恢复系。
[0021] 所述的应用，还可以以抗磺酰脲类除草剂油菜为父本，普通油菜为母本杂交获得 F1，然后以普通油菜为轮回亲本，在每次回交世代前，采用本发明的分子标记BsrDI-ALS3R 进行基因型检测，将含分子量为766bp、570bp和196bp三种条带的抗性基因杂合型单株与 轮回亲本回交，通过多次回交，在最后一代自交的群体中用权利要求1所述引物的核甘酸 序列SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2对甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R进行分子 标记辅助基因型检测，选择含分子量为766bp条带的抗性基因纯合型单株即培育出抗除草 剂油菜。
[0022] 有益效果
[0023] 与现有技术相比，本发明具有下列优点和效果：
[0024] 1、本发明找到一种检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的CAPS分子 标记方法，克服了甘蓝型油菜基因组复杂、在四倍体油菜中应用分子标记难度很大的问题。
[0025] 本发明开展了大量的检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的AS-PCR 分子标记、ARMS-PCR分子标记、CAPS分子标记的开发研宄，摸索试验中发现敏感性油菜的 乙酰乳酸合酶III基因正义链起始密码子第一个核甘酸下游的+1662至+1667位点，该位 点的6个核甘酸序列为"GCAATG"，能够被限制性核酸内切酶BsrDI酶识别并剪切，而抗磺酰 脲类除草剂基因BnALS3R在+1662至+1667的对应序列为"GCAATT"，不能被限制性核酸内 切酶BsrD I酶识别并剪切，从而克服了甘蓝型油菜为白菜型油菜（A基因组）和甘蓝（C基 因组）天然杂交自然加倍而来的异源四倍体（2n = 38)，基因组相对复杂，二倍体研发的分 子标记在四倍体油菜的应用难度很大的问题，找到一种检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂 基因BnALS3R的CAPS分子标记方法，
[0026] 2、本发明提供的分子标记检测方法操作简便、结果准确可靠、容易判断。
[0027] 本发明的分子标记位于敏感性油菜的乙酰乳酸合酶III基因正义链起始密码子 第一个核甘酸下游的+1662至+1667位点，该位点的6个核甘酸序列为"GCAATG"，能够被限 制性核酸内切酶BsrDI酶识别并剪切，而抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R在+1662至+1667 的对应序列为"GCAATT"，不能被限制性核酸内切酶BsrD I酶识别并剪切。由此，可以开发 一个能够检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的CAPS分子标记BsrDI-ALS3R。
[0028] 该分子标记是一个共显性标记，操作者仅需要通过简单的分子生物学实验手段 (PCR扩增和酶切反应）就能对不同抗性基因型进行鉴定，快速、准确的区分出抗磺酰脲类 除草剂基因BnALS3R的纯合型、杂合型和不抗除草剂的敏感型油菜植株。
[0029] 3、本发明提供的分子标记检测方法能有效用于抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R 引起的油菜对磺酰脲类除草剂抗性的标记辅助选择育种。
[0030] 常规育种方法是利用含BnALS3R基因的抗性油菜M342与生产上推广的主栽品种 进行杂交和回交，然后在每个分离后代中喷施除草剂进行鉴定，最终选择含抗磺酰脲类除 草剂BnALS3R的抗性单株。在每个分离后代除草剂鉴定过程中，如果除草剂剂量使用不当 或喷施不均匀极易可能导致误选或所需要的材料死亡。另外，有时在抗除草剂基因研宄过 程中需要保存不抗的材料，用作比较研宄。因此，利用与BnALS3R基因直接相关的PCR分子 标记对植株DNA进行检测，可以在油菜任何时期鉴定出抗性基因纯合基因型单株以及优良 性状的不抗单株，淘汰其它单株，这样不仅可以节约田间育种成本，而且可以大大提高抗除 草剂油菜品种的选择进程。
[0031] 4、本发