赭曲霉毒素a核酸适配体及其在样品磁分离前处理中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别涉及一种赭曲霉毒素A核酸适配体及其在样品磁 分离前处理中的应用。
【背景技术】
[0002] 真菌毒素是影响农产品质量安全的主要危害因子之一，其中赭曲霉毒素 A(0chrat〇xinA，0TA)主要由曲霉和靑霉等产生，在自然界中广泛存在，其中以粮食（小 麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等）、花生、蔬菜（豆类）等农作物上居多，具有肝肾 毒性以及很强的致畸、致癌和致突变作用等多中毒性，对动物和人体健康具有很大的潜在 危害。鉴于此，世界各国均重视对0TA的检测和控制，纷纷制定出了粮食和饲料中0TA相关 限量标准，如欧盟规定谷物原料0TA最大限量5yg/kg，谷物加工制品最大限量3yg/kg;我 国规定谷类、豆类中OTA最大限量5yg/kg，以保护人民健康和调控进出口粮食。
[0003] 目前检测0TA的主要方法是薄层色谱法（TLC)、高效液相色谱法（HPLC)、酶联免疫 吸附法（ELISA)等。TLC法简单，检测成本低，但是灵敏度较差、重现性不好且无法实现自动 化；HPLC法灵敏度高，但所需仪器昂贵、前处理复杂、检测成本高，不适合大量样品的快速 筛查。ELISA法灵敏度高、特异性好，但所依赖的高质量抗体的制备周期很长且存在交叉反 应的问题。
[0004] 目前世界上通用的真菌毒素检测方法主要分两大类：化学分析法和免疫分析法。 薄层色谱法（TLC)、微柱法、高效液相色谱法（HPLC)等属于化学分析法，这些检测方法灵敏 度高、准确度好，但是样品前处理复杂、检测较为耗时、仪器设备比较贵重，且对检测人员具 有较高的技术要求。酶联免疫吸附法（ELISA)灵敏、安全、快捷、抗干扰，是目前普遍实用的 真菌毒素免疫检测方法，然而像赭曲霉毒素A这类小分子毒性较高，抗体制备周期长、技术 难度大、批间差异大，且制备好的抗体不易保存、易失活，这些缺点大大限制了免疫学分析 方法的推广和快速发展。核酸适配体作为一类单链寡核苷酸，被称作"化学抗体"，与抗体相 比具有靶标范围广（甚至是毒性靶标）、可体外制备、开发周期短、生产成本低、特异性高、 稳定性好、品质均一、批间差异小且易于化学合成和修饰等优点。目前，基于核酸适配体的 快速检测技术研发越来越热，在医学检测领域已经非常广泛。因此，针对赭曲霉毒素的分子 识别元件核酸适配体的开发具有重要的研宄意义和广阔的应用前景。
【发明内容】
[0005] 为克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种赭曲霉毒素A核 酸适配体。所述的核酸适配体能够特异性识别0TA，其筛选过程采用固态靶标磁分离筛选策 略。
[0006] 本发明的另一目的在于提供上述的赭曲霉毒素A核酸适配体在样品磁分离前处 理中的应用。用于样品中0TA的分离、纯化、富集。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种赭曲霉毒素A核酸适配体，其核苷酸 序列如下所示：
[0008] 5' -CTTCGGGTGTGGGTGGCA TTCCGGTAGGCTCTG-3'。
[0009] 根据在线软件模拟，所述0TA核酸适配体具有如图6所示的二级结构。
[0010] 所述赭曲霉毒素A核酸适配体包括上述赭曲霉毒素A核酸适配体的衍生序列，所 述衍生序列为氨基修饰核酸序列，具有与上述原序列相同的功能。
[0011] 所述的赭曲霉毒素A核酸适配体包括氨基修饰上述核苷酸序列的衍生序列，所述 的氨基修饰核酸序列的衍生序列具有与赭曲霉毒素A核酸适配体原序列相同的从样品中 进行赭曲霉毒素A磁分离功能。
[0012] 所述的赭曲霉毒素A核酸适配体应用于样品磁分离前处理，具体为应用于样品中 赭曲霉毒素A分离前处理，包括如下步骤：
[0013] (1)将氨基修饰的赭曲霉毒素A核酸适配体交联到羧基修饰的磁珠上；
[0014] (2)将修饰有赭曲霉毒素A核酸适配体的磁珠与含有赭曲霉毒素A的样品提取液 进行混合；利用磁分离架富集磁珠，然后洗涤，最后洗脱得到纯度/浓度较高的赭曲霉毒素 A待测样。
[0015] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0016] 1)本发明的赭曲霉毒素A核酸适配体通过固态靶标磁分离筛选策略获得，筛选过 程操作简单，筛选效率高；
[0017] 2)与抗体相比，核酸适配体作为一种单链DNA，稳定性好，便于保存，易于修饰与 标记，同时可以大量化学合成，批次间差异小，成本低廉。
【附图说明】
[0018] 图1 :0TA在磁珠上的固定效果：a) 200nM0TA在磁珠上固定后上清液的荧光强度； b)200nM0TA溶液固定反应前的荧光强度；最佳激发波长Aex = 370nm，最佳发射波长入em =430nm;激发、发射狭缝宽度为2. 5nm〇
[0019]图2:筛选文库亲和力随筛选轮次增加的变化情况：将上一轮新纯化的荧光标记 的文库与0TA修饰的磁珠一起孵育，洗涤后再洗脱，进行荧光强度测试，第6轮后每3轮检 测一次。
[0020] 图3:筛选文库结合特异性考察：荧光基团标记的0TA核酸适配体在与0TA修饰的 磁珠孵育后，分别用含有0TB、氮乙酰基苯丙氨酸、华法令的缓冲液洗脱，最后再用含有0TA 的缓冲液洗脱，然后对洗脱液进行荧光强度测试。
[0021] 图4:氨基修饰赭曲霉毒素核酸适配体在磁珠上的交联结果：A)交联反应后磁分 离，上清；B)交联反应前，0TA核酸适配体原液；M)DNAmark。
[0022] 图5 :0TA核酸适配体修饰磁珠的磁分离效果：a)为500nM的OTA乙腈水溶液（1 : 1) ;b)同浓度的0TA筛选缓冲液经过0TA核酸适配体修饰的磁珠捕获一一磁分离一一洗脱 后的乙腈水溶液（1 :1) ;c)为同浓度的0TA筛选缓冲液经过裸磁珠捕获 磁分尚 洗 脱后的乙腈水溶液（1 :1);最佳激发波长入ex= 370nm，最佳发射波长Aem= 430nm;激 发、发射狭缝宽度为5.Onm。
[0023] 图6 :0TA核酸适配体的二级结构图。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0025] 实施例1赭曲霉毒素A核酸适配体的固态靶标磁分离筛选
[0026]筛选所用的DNA文库（5' -CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTGN30GACTCG AAGTCGTGCATCTGCA-3'）用lXPBSMg缓冲液（10mMPBS，150MmNaCl，2.6mMKCl，lmMMgCl， pH值7. 2)溶解后，于95°C变性5min后，迅速置于冰上冷却5min。然后，将预处理过的文库 加入PBS洗涤过的氨基磁珠（用量与0TA固定时的用量保持一致），37°C震荡孵育30min， 随后磁分离收集上清液，将其加入含有OTA修饰过的磁球离心管，37°C震荡孵育一定时间， 之后根据筛选的需要适时采取含有一定浓度的氮乙酰基苯丙氨酸和华法令的lXPBSMg缓 冲液洗涤一定次数，600y1/次；最后再用1XPBS洗涤一定次数，600y1PBS/次。往上述 洗涤过的含有磁珠的离心管中加150y1ddH20,混匀后将该混合溶液转移至另一新的离心 管中，在用150y1ddH20润洗原管一次，将两次溶液合并到同一新管中，共计300y1 (含磁 珠）。随后，将此离心管置于恒温金属浴上95°C加热lOmin，-20°C冷却5min，磁分离收集上 清液进行PCR扩增。PCR扩增所用引物序列为Pr