专利名称：利用电化学核酸适配体传感器一步快速检测赭曲霉毒素ａ的方法
技术领域：
本发明属于食品检测技术领域，具体涉及食品中赭曲霉毒素A的检测方法。
背景技术：
赭曲霉毒素A广泛存在自然界中，其毒性强，对人类和动植物损害极大。赭曲霉毒素A是由多种生长在粮食(小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等)、花生、蔬菜(豆类)等农作物上的曲霉和青霉等产生。动物摄入了霉变的饲料后，这种毒素也可能出现在猪和母鸡等的肌肉组织中。赭曲霉毒素A主要侵害动物肝脏与肾脏。这种毒素主要是引起肾脏损伤，大量的毒素也可能引起动物的肠黏膜炎症和坏死。在动物试验中观察到它的致畸作用。
赭曲霉毒素A毒性很强，并且广泛存在于各种食物、谷物及其副产品中。为了保障人类的健康，非常有必要开展食品中赭曲霉毒素A的检测研究。赭曲霉毒素A的含量通常很低，所以对检测手段的要求较高，检测OTA的定性方法有微柱法，定量分析方法有薄层色谱法、高效薄层色谱法、HPLC、酶联免疫吸附法和荧光比色法等。薄层层析法的优点是方法简单，使用的试剂价格便宜，但是存在灵敏度较差，所需试剂繁多，检测周期长，重现性不好和无法实现自动化等缺点，已不能满足现代检测的要求。色谱法可以定性、定量，但是仪器昂贵，操作复杂且不适合用于大批量样品的检测，而且不能用于现场的快速检测。现场快速筛选方法以酶联免疫吸附法较多。但这种方法是基于抗原-抗体的亲和反应，以抗体作为识别分子。由于抗体容易受到外界环境尤其是温度的影响，限制了方法的灵活应用。此外，抗体制备也需经过动物实验或者细胞实验，繁琐费时，制备成本高，检测的成本也高。所以有必要发展一种快速方便，检测成本低，检测灵敏度高的新型检测方法。
发明内容
为了解决现有赭曲霉毒素A检测成本高、检测方案复杂、检测时间过长的缺点，本发明提供一种利用电化学核酸适配体传感器一步快速检测赭曲霉毒素A的方法。具体的技术解决方案如下在有赭曲霉毒素A存在的情况下，本发明中所述适配体与赭曲霉毒素A特异性结合，引起核酸适配体的空间结构变化，进一步影响核酸适配体上修饰的电化学活性物质亚甲基蓝与电极表面电子传递的速率，从而影响电化学活性物质亚甲基蓝的氧化还原峰电流值，通过电化学活性物质亚甲基蓝显示的氧化还原峰电流值与赭曲霉毒素A浓度之间的线性变化关系，建立赭曲霉毒素A的一步快速电化学传感器检测新方法。本发明利用电化学核酸适配体传感器一步快速检测赭曲霉毒素A方法的具体操作步骤如下
(I).裸金电极表面的抛光处理
将裸金电极在浓度0. 3 mmol/L的氧化铝粉末水溶液中打磨抛光处理5min，再在浓度0.05 mmol/L的氧化铝粉末水溶液中打磨抛光处理5 min，然后在无水乙醇溶液中超声清洗5 min，最后在去离子水中超声清洗5 min，彻底除去非特异性吸附在裸金电极表面的氧化招粉末；
(2).适配体电化学传感器的修饰
取ImL浓度I mmol/L的三(P-氯乙基)磷酸酯，加入到99 mL浓度为lmmol/L的赭曲霉毒素A核酸适配体溶液中，室温下活化孵育30 min，得到活化的赭曲霉毒素A核酸适配体溶液；取6 mL浓度lmmol/L活化的赭曲霉毒素A核酸适配体溶液，滴加在步骤(I)抛光处理后的裸金电极表面，温度30°C条件下孵育2h，得到赭曲霉毒素A核酸适配体修饰的电极；用去离子水清洗赭曲霉毒素A核酸适配体修饰的电极2 3次，得到清洗过的电极；将清洗过的电极浸没在200mL浓度2mmol/L的6-巯基己醇中，并在温度30°C条件下封闭4h，得到表面封闭过的电极，用去离子水清洗表面封闭过的电极，即得用于一步法检测赭曲霉毒素A的电化学核酸适配体传感器；
赭曲霉毒素A核酸适配体为单链DNA探针，所述单链DNA探针的序列从5’端到3’端为 GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA，所述单链 DNA 探针的 3’ 末端修饰了巯基，5’末端修饰了电化学活性物质亚甲基蓝；
浓度为lmmol/L的赭曲霉毒素A核酸适配体溶液是3’末端修饰了巯基和5’末端修饰了亚甲基蓝的DNA适配体探针溶液；
(3).对赭曲霉毒素A标准浓度溶液进行检测，建立标准曲线
将电化学核酸适配体传感器作为工作电极，银/氯化银(Ag/AgCl)电极作为参比电极，钼丝电极作为对电极，置于10 mL浓度100 mmol/L的Tris-HCl缓冲液中，Tris-HCl缓冲液的PH值为7. 4，在Tris-HCl缓冲液中加入浓度为lmg/L的赭曲霉毒素A标准溶液，得到含有赭曲霉毒素A浓度0. 01pg/mL的溶液,置入所述工作电极,室温孵育反应5 IOmin ；扫描方波伏安图谱，扫描高电位为0 V，低电位为-0.4 V，频率50 Hz，电位增量为0.001 V，振幅为0. 05 V,得到含有赭曲霉毒素A浓度为0. 01pg/mL的氧化还原峰图谱及其氧化还原峰电流；
同理，在含有赭曲霉毒素A浓度0.01pg/mL的溶液中接着加入浓度为lmg/L赭曲霉毒素A标准溶液分别得到含有赭曲霉毒素A的终浓度为0. lpg/mL的溶液A、含有赭曲霉毒素A的终浓度为I pg/mL的溶液B、含有赭曲霉毒素A的终浓度为10 pg/mL的溶液C、含有赭曲霉毒素A的终浓度为100pg/mL的的溶液D，所述溶液A、溶液B、溶液C和溶液D为四种标准液；将工作电极分别依次置入四种标准液中，分别反应5 IOmin ;分别扫描四种标准液的方波伏安图谱并记录相应的氧化还原峰电流值；以含有赭曲霉毒素A浓度0. 01pg/mL的溶液和四种标准液对应的氧化还原峰峰电流值作为纵坐标，以含有0. 01pg/mL的赭曲霉毒素A溶液的浓度和四种标准赭曲霉毒素A溶液的浓度作为横坐标,建立赭曲霉毒素一步法检测的标准曲线；
(4).对含赭曲霉毒素A的实际样品溶液进行定量检测
将作为工作电极的电化学核酸适配体传感器浸没在10 mL浓度为100 mmol/L的Tris-HCl缓冲液中，Tris-HCl缓冲液的pH值为7. 4，在Tris-HCl缓冲液中加入含有未知浓度的赭曲霉毒素A溶液,反应5 10 min,扫描方波伏安图谱,扫描高电位为0 V，低电位为-0.4 V，频率50 Hz，电位增量为0. 001V，振幅0. 05 V ;得到特定浓度赭曲霉毒素对应的氧化还原峰峰电流值，通过所述赭曲霉毒素一步法检测标准曲线，计算出所述未知浓度的赭曲霉毒素A溶液中赭曲霉毒素A的浓度。检测赭曲霉毒素A所用的生物传感器,是对目标赭曲霉毒素A敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器。是由固定化的生物敏感材料作识别探针(包括酶、抗体、抗原、微生物、细胞、组织、核酸等生物活性物质)与适当的理化换能器(如氧电极、光敏管、场效应管、压电晶体等等)及信号放大装置构成的分析工具或系统。核酸适配体是通过指数富集配体的系统计划技术筛选而来的。与抗体相比，核酸适配体具有易合成、易修饰、易固定、可反复使用和长期保存的优点。电化学核酸适配体传感器在快速检验中发挥着重要作用，它将电化学信号传导的高灵敏性和核酸适配体的高亲和性相结合。电化学核酸适配体传感器制备简便、易修饰、灵敏高、测试费用低、适于联机化、稳定性好和结合目标物范围广等优点。本发明解决了赭曲霉毒素A检测成本高，检测方案复杂，检测时间过长的缺点。本发明采用可特异性识赭曲霉毒素A的核酸适配体应用于电化学传感器，大大的提高了检测的灵敏性，降低了检测成本，并且检测快速，只需一步，不需要复杂的检测手段和昂贵的仪器，是一种快速方便，检测成本低，检测灵敏度高的新型一步现场检测方法。
综上所述本发明的有益效果具体体现在以下方面
1.本发明采用能与赭曲霉毒素A特异性结合的核酸适配体探针作为识别探针，构建相关的传感界面作为生物传感器用于检测，提高了检测赭曲霉毒素的灵敏性，最低可以检测出0. 01 pg/mL的赭曲霉毒素A ;
2.本发明作为基于核酸适配体的电化学检测赭曲霉毒素A的一种方法，大大降低了检测目标毒素的成本，操作简单方便；
3.本发明一步快速检测赭曲霉毒素A，电化学核酸适配体传感器制备完成后，仅需5 10 min就可以实现一步检测出赭曲霉毒素A。
图I为赭曲霉毒素A标准品溶液检测得到的标准曲线图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步地描述。实施例
(1)裸金电极表面的抛光处理
将裸金电极在浓度0. 3 mmol/L的氧化铝粉末水溶液中打磨抛光处理5 min，再在浓度0.05 mol/L的氧化铝粉末水溶液中打磨抛光处理5 min，然后在无水乙醇溶液中超声清洗5 min，最后在去离子水中超声清洗5 min，彻底除去非特异性吸附在裸金电极表面的氧化招粉末；
(2)适配体电化学传感器的修饰
取2 mL浓度I mmol/L的三(P-氯乙基)磷酸酯，加入到198 mL浓度为I mmol/L的赭曲霉毒素A核酸适配体溶液中，室温下活化孵育30 min，得到活化的赭曲霉毒素A核酸适配体溶液；取12 mL浓度I mmol/L活化的赭曲霉毒素A核酸适配体溶液，滴加在(I)中抛光处理后的裸金电极表面，温度30°C条件下孵育2 h，得到赭曲霉毒素A核酸适配体修饰的电极；用去离子水清洗核酸适配体修饰的电极2 3次，得到清洗过的电极；将清洗过的电极浸没在200 mL浓度2 mmol/L的6-巯基己醇中，并在温度30 °C条件下封闭4 h，得到表面封闭过的电极，用去离子水清洗表面封闭过的电极，即得用于一步法检测赭曲霉毒素A的电化学核酸适配体传感器；
与赭曲霉毒素A特异性结合的核酸适配体为单链DNA探针，该单链DNA的序列从5’端到 3’端为 GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA，该单链 DNA 的 3’末端修饰了巯基，5’末端修饰了电化学活性物质亚甲基蓝；
所述与赭曲霉毒素A特异性结合的核酸适配体溶液是3’末端修饰了巯基和5’末端修饰了亚甲基蓝的DNA适配体探针溶液；
(3)对赭曲霉毒素A标准浓度溶液进行检测，建立标准曲线 将电化学核酸适配体传感器作为工作电极，银/氯化银(Ag/AgCl)电极作为参比电极，钼丝电极作为对电极，置于10 mL浓度100 mmol/L的Tris-HCl缓冲液中，Tris-HCl缓冲液的PH值为7. 4，在Tris-HCl缓冲液中加入浓度为I mg/L的赭曲霉毒素A标准溶液，得到含有赭曲霉毒素A浓度为0. 01 pg/mL的溶液，将工作电极置入后，室温孵育反应5 IOmin ;扫描方波伏安图谱，扫描高电位为0 V，低电位为-0.4 V，频率50 Hz，电位增量为0.001 V，振幅为0.05 V，得到含有赭曲霉毒素A浓度为0.01pg/mL的氧化还原峰图谱及其氧化还原峰电流；
同理，在含有赭曲霉毒素A浓度0.01 pg/mL的溶液中接着加入浓度为I mg/L赭曲霉毒素A标准溶液分别得到含有赭曲霉毒素A的终浓度为0. I pg/mL的溶液A、含有赭曲霉毒素A的终浓度为I pg/mL的溶液B、含有赭曲霉毒素A的终浓度为10 pg/mL的溶液C、含有赭曲霉毒素A的终浓度为100pg/mL的的溶液D，所述溶液A、溶液B、溶液C和溶液D为四种标准液；将工作电极分别依次置入四种标准液中，分别反应5 IOmin ;分别扫描四种标准液的方波伏安图谱并记录相应的氧化还原峰电流值；以五种赭曲霉毒素A浓度对应的氧化还原峰峰电流值作为纵坐标，以赭曲霉毒素A的浓度作为横坐标,建立赭曲霉毒素一步法检测的标准曲线；
(4)对含赭曲霉毒素A的红酒样品溶液进行定量检测
将作为工作电极的电化学核酸适配体传感器浸没在10 mL浓度为100 mmol/L的Tris-HCl缓冲液中，Tris-HCl缓冲液的pH值为7. 4，在Tris-HCl缓冲液中加入I mL含有未知浓度的赭曲霉毒素A红酒溶液,反应5 10 min,扫描方波伏安图谱,扫描高电位为0V,低电位为-0.4 V，频率50 Hz，电位增量为0.001V，振幅0.05 V ;得到含有特定浓度赭曲霉毒素A红酒样品对应的氧化还原峰峰电流值，通过所述赭曲霉毒素A —步法检测标准曲线，计算出红酒样品中赭曲霉毒素A的浓度。
权利要求
1.利用电化学核酸适配体传感器一步快速检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于所述方法的具体操作步骤如下 (1).裸金电极表面的抛光处理 将裸金电极在浓度0. 3 mmol/L的氧化铝粉末水溶液中打磨抛光处理5min，再在浓度.0.05 mmol/L的氧化铝粉末水溶液中打磨抛光处理5 min，然后在无水乙醇溶液中超声清洗.5 min，最后在去离子水中超声清洗5 min，彻底除去非特异性吸附在裸金电极表面的氧化招粉末； (2).适配体电化学传感器的修饰 取ImL浓度I mmol/L的三(P-氯乙基)磷酸酯，加入到99 mL浓度为lmmol/L的赭曲霉毒素A核酸适配体溶液中，室温下活化孵育30 min，得到活化的赭曲霉毒素A核酸适配体溶液；取6 mL浓度lmmol/L活化的赭曲霉毒素A核酸适配体溶液，滴加在步骤(I)抛光处理后的裸金电极表面，温度30°C条件下孵育2h，得到赭曲霉毒素A核酸适配体修饰的电极；用去离子水清洗赭曲霉毒素A核酸适配体修饰的电极2 3次，得到清洗过的电极；将清洗过的电极浸没在200mL浓度2mmol/L的6-巯基己醇中，并在温度30°C条件下封闭4h，得到表面封闭过的电极，用去离子水清洗表面封闭过的电极，即得用于一步法检测赭曲霉毒素A的电化学核酸适配体传感器； 赭曲霉毒素A核酸适配体为单链DNA探针，所述单链DNA探针的序列从5’端到3’端为 GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA，所述单链 DNA 探针的 3’ 末端修饰了巯基，5’末端修饰了电化学活性物质亚甲基蓝； 浓度为lmmol/L的赭曲霉毒素A核酸适配体溶液是3’末端修饰了巯基和5’末端修饰了亚甲基蓝的DNA适配体探针溶液； (3).对赭曲霉毒素A标准浓度溶液进行检测，建立标准曲线 将电化学核酸适配体传感器作为工作电极，银/氯化银(Ag/AgCl)电极作为参比电极，钼丝电极作为对电极，置于10 mL浓度100 mmol/L的Tris-HCl缓冲液中，Tris-HCl缓冲液的PH值为7. 4，在Tris-HCl缓冲液中加入浓度为lmg/L的赭曲霉毒素A标准溶液，得到含有赭曲霉毒素A浓度0. 01pg/mL的溶液,置入所述工作电极,室温孵育反应5 IOmin ；扫描方波伏安图谱，扫描高电位为0 V，低电位为-0.4 V，频率50 Hz，电位增量为0.001 V，振幅为0. 05 V,得到含有赭曲霉毒素A浓度为0. 01pg/mL的氧化还原峰图谱及其氧化还原峰电流； 同理，在含有赭曲霉毒素A浓度0.01pg/mL的溶液中接着加入浓度为lmg/L赭曲霉毒素A标准溶液分别得到含有赭曲霉毒素A的终浓度为0. lpg/mL的溶液A、含有赭曲霉毒素A的终浓度为I pg/mL的溶液B、含有赭曲霉毒素A的终浓度为10 pg/mL的溶液C、含有赭曲霉毒素A的终浓度为100pg/mL的的溶液D，所述溶液A、溶液B、溶液C和溶液D为四种标准液；将工作电极分别依次置入四种标准液中，分别反应5 IOmin ;分别扫描四种标准液的方波伏安图谱并记录相应的氧化还原峰电流值；以含有赭曲霉毒素A浓度0. 01pg/mL的溶液和四种标准液对应的氧化还原峰峰电流值作为纵坐标，以含有0. 01pg/mL的赭曲霉毒素A溶液的浓度和四种标准赭曲霉毒素A溶液的浓度作为横坐标,建立赭曲霉毒素一步法检测的标准曲线； (4).对含赭曲霉毒素A的实际样品溶液进行定量检测将作为工作电极的电化学核酸适配体传感器浸没在10 mL浓度为100 mmol/L的Tris-HCl缓冲液中，Tris-HCl缓冲液的pH值为7. 4，在Tris-HCl缓冲液中加入含有未知浓度的赭曲霉毒素A溶液,反应5 10 min,扫描方波伏安图谱,扫描高电位为0 V，低电位为-0.4 V，频率50 Hz，电位增量为0. 001V，振幅0. 05 V ;得到特定浓度赭曲霉毒素对应的氧化还原峰峰电流值，通 过所述赭曲霉毒素一步法检测标准曲线，计算出所述未知浓度的赭曲霉毒素A溶液中赭曲霉毒素A的浓度。
全文摘要
本发明涉及利用电化学核酸适配体传感器快速一步检测赭曲霉毒素Ａ的方法。所述方法的具体操作步骤如下(1)裸金电极表面的抛光处理，(2)适配体电化学传感器的修饰；(3)对赭曲霉毒素A标准浓度溶液进行检测，建立标准曲线；(4)对含赭曲霉毒素A的实际样品溶液进行定量检测。本发明提高了检测赭曲霉毒素的灵敏性，最低可以检测出0.01pg/mL的赭曲霉毒素A；大大降低了检测目标毒素的成本，操作简单方便；仅需5～10min就可以实现一步检测出赭曲霉毒素A。
文档编号G01N27/48GK102735740SQ20121019431
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月14日 优先权日2012年6月14日
发明者吴晶晶, 张睿, 梅占龙, 蒋原, 薛峰, 陈伟, 陈寒清 申请人:合肥工业大学