水，标号为LNN01，其基液中添加有由半胱胺、白血病抑制因 子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为5mM，LIF浓度为2525IU/mL，Y27632 浓度为50mM。
[0108] 本实施例提供了一种爽肤水，标号为LNN02,其基液中添加有由半胱胺、白血病 抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为250mM，LIF浓度为50IU/mL， Y27632 浓度为 0. 5mM。
[0109] 本实施例提供了一种爽肤水，标号为LNN03,其基液中添加有由半胱胺、白血病抑 制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为500mM，LIF浓度为5X103IU/mL， Y27632 浓度为 25mM。
[0110] 本实施例提供了一种爽肤水，标号为LNN04,其基液中添加有组合物LN02,面膜基 液中半胱胺浓度为10mM，LIF浓度为103U/mL，Y27632浓度为10mM。
[0111] 实施例9 本实施例提供了一种面霜，标号为LNFC01，其基液中添加有由半胱胺、白血病抑制因子 和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为5mM，LIF浓度为2525IU/mL，Y27632浓 度为50mM。
[0112] 本实施例提供了一种面霜，标号为LNFC02,其基液中添加有由半胱胺、白血病抑制 因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为250mM，LIF浓度为50IU/mL，Y27632 浓度为〇. 5mM。
[0113] 本实施例提供了一种面霜，标号为LNFC03,其基液中添加有由半胱胺、白血病抑 制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为500mM，LIF浓度为5X103IU/mL， Y27632 浓度为 25mM。
[0114] 本实施例提供了一种面霜，标号为LNFC03,其基液中添加有组合物LN02,面膜基 液中半胱胺浓度为10mM，LIF浓度为103U/mL，Y27632浓度为10mM。
[0115] 实施例10 本实施例提供了一种洗面乳，标号为LNCF01，其基液中添加有由半胱胺、白血病抑制因 子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为5mM，LIF浓度为2525IU/mL，Y27632 浓度为50mM。
[0116] 本实施例提供了一种洗面乳，标号为LNCF02,其基液中添加有由半胱胺、白血病 抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为250mM，LIF浓度为50IU/mL， Y27632 浓度为 0. 5mM。
[0117] 本实施例提供了一种洗面乳，标号为LNCF03,其基液中添加有由半胱胺、白血病抑 制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为500mM，LIF浓度为5X103IU/mL， Y27632 浓度为 25mM。
[0118] 本实施例提供了一种洗面乳，标号为LNCF04,其基液中添加有组合物LN02,面膜 基液中半胱胺浓度为10mM，LIF浓度为103U/mL，Y27632浓度为10mM。
[0119] 实施例11 (1)山羊卵母细胞体外成熟（IVM)培养 山羊的卵巢取自屠宰场。在实验室中，卵巢的滤泡用刀片划破后，用磷酸缓冲液 (D-PBS)漂洗卵巢的表面，山羊卵母细胞从培养液中收集，并在D-PBS中漂洗3次，放入卵母 细胞成熟液中。卵母细胞成熟液的组成是M199 (Invitrogen)含有L~谷氨酰氨，2. 2g/L 碳酸氢钠，25mMHEPES(sigma，USA)，并添加 10% (V/V)胎奶牛血清（Fisher，USA)，0.5mg/mL羊FSH(SiouX，USA)，5.0mg/mL羊LH(SiouX，USA)，1.0mg/mL17_b雌二醇 (sigma，USA)。20~25个山羊卵母细胞移至在75mL成熟液滴中，放置于38. 5度，5% 0)2培 养箱中，培养22-24小时，如图1A所示；山羊卵母细胞在三个细胞因子的作用下，恢复减数 分裂到MII期，山羊卵母细胞外周的卵丘细胞用透明质酸酶处理3分钟后去除，变成光亮的 卵子，在透明带与卵子的卵周隙之间排放第一极体，如图1B中箭头所示；经过体外受精，卵 子出现雌雄两个原核，如图1C中箭头所示；受精卵在体外培养下，分裂成8细胞，如图1D所 示；和经过7. 5天的培养发育成囊胚，如图1E所示；在荧光染色的条件下，山羊的囊胚显示 305正常的细胞核，如图1F所示。
[0120] 我们进行了 3X3的排列组合实验，在卵母细胞成熟培养液添加单一因子、两个 因子和三因子组合的成分，检查经过IVM后山羊卵母细胞进入MII成熟卵母细胞的比例，其 结果如表1所示。在单因子与组合因子的添加中，半胱胺的浓度为100mM(Sigma，USA)， LIF浓度为 103IU/mL(InVitrogen，USA)，Y27632 的浓度为 10mM(RenovaLifeInc.， USA)，这三个因子在单因子处理组、双因子处理组或三因子的处理组中添加浓度保持不变。
[0121] 表1.半胱胺，LIF，小分子Y27632协同促进山羊卵母细胞的体外成熟
【主权项】
1. 一种用于卵母细胞、皮肤成体干细胞培养的组合物，其包括半胱胺。
2. 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述组合物还包括白血病抑制因子。
3. 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述组合物还包括白血病抑制因子和 Rho激酶抑制剂Y27632。
4. 根据权利要求3所述的组合物，其特征在于：所述组合物中半胱胺、白血病抑制因子 和 Rho 激酶抑制剂 Y27632 配比为（lmmol-100mmol):(10IU-103 IU):(0.1m mol -lOmmol)。
5. -种用于卵母细胞、IVF受精卵、IVF胚胎、皮肤组织或皮肤成体干细胞培养的培养 液或培养基，其特征在于：包含权利要求1至4中任一所述的组合物。
6. 根据权利要求5所述的培养液或培养基，其用于皮肤组织或皮肤成体干细胞的培 养，其特征在于：所述组合物包含半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂Y27632,所述 培养液或培养基中半胱胺浓度为5mM -500禮，白血病抑制因子浓度为50 IU/mL -5X103IU/mL，Rho 激酶抑制剂 Y27632 浓度为 0. 5mM -50 mM。
7. 根据权利要求5所述的培养液或培养基，其用于卵母细胞、IVF受精卵或IVF胚胎培 养，其特征在于：所述组合物包含半胱胺和白血病抑制因子，所述培养液或培养基中半胱胺 浓度为IOmM _200mM，白血病抑制因子浓度为IO2 IU/mL -2X103 IU/mL ; 所述组合物包含半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂Y27632,所述培养液或培 养基中半胱胺浓度为IOmM _200mM，白血病抑制因子浓度为IO2 IU/mL -2X IO3 IU/mL，Rho 激酶抑制剂Y27632浓度为lmM-20 mM。
8. 如权利要求1至4中任一所述的组合物在卵母细胞体外成熟培养、IVF受精卵或IVF 胚胎体外培养中的应用。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述卵细胞、IVF受精卵或IVF胚胎选自 人或下述任一一种动物：山羊、绵羊、奶牛、猪，家兔、小鼠、大鼠或豚鼠。
10. 如权利要求1至4中任一所述的组合物在皮肤成体干细胞、皮肤组织培养中的应 用。
11. 如权利要求1至4中任一所述的组合物在制备治疗创伤性皮肤缺损、皮肤溃疡的药 物或试剂中的应用。
12. -种化妆品或者化妆品辅助添加剂，其特征在于：包含权利要求1至4中任一所述 的组合物。
13. 如权利要求1至4中任一所述的组合物在制备化妆品或化妆品辅助添加剂中的应 用。
14. 根据权利要求13所述的应用，其特征在于：所述化妆品为面膜，所述面膜包括用于 涂抹于面部的涂抹物，所述组合物应用于所述涂抹物的制备。
15. 根据权利要求13所述的应用，其特征在于：所述化妆品为面膜，所述面膜包括由蚕 丝或棉制成的贴敷物，以及用于浸润所述贴敷物的基液，所述组合物应用于所述基液的制 备。
16. 根据权利要求13所述的应用，其特征在于：所述化妆品为爽肤水、面霜或洗面乳。
【专利摘要】本发明提供了一种用于卵母细胞、皮肤成体干细胞培养的组合物及应用，该组合物能够提高卵母细胞的体外成熟率，并提高卵子的分裂率、胚胎发育到桑椹和囊胚的比率，进而大幅促进体外受精的受精卵向胚胎发育。同时，该组合物能够有效抑制皮肤成体干细胞向成纤维细胞分化，或维持皮肤成体干细胞的自我更新与再生。该组合物包括半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂Y27632。
【IPC分类】A61P17-02, C12N5-075, A61K8-98, C12N5-074, A61K45-06
【公开号】CN104830754
【申请号】CN201510231663
【发明人】杜福良, 杨澜, 安礼友, 薛非
【申请人】兰诺生物技术无锡有限公司
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年5月8日