的酶制剂，所述钩虫贪铜菌是钩虫贪铜菌NBRC102504。
[0060][18]、用于定量L-苏氨酸的酶传感器，其特征在于，在检测用电极上直接或间接 地固定或布置了来源于钩虫贪铜菌的L-苏氨酸脱氢酶或具有下述（1)-(3)中的任一氨基 酸序列且具有L-苏氨酸脱氢酶活性的蛋白质：
[0061] (1)序列表的序列号1记载的氨基酸序列；
[0062] (2)在序列表的序列号1记载的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加1~30个氨 基酸而得到的氨基酸序列；
[0063] (3)相对于序列表的序列号1记载的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸 序列。
[0064] 发明的效果
[0065] 通过本发明，由TDH将样品中的L-苏氨酸脱氢，还原辅酶NAD+，定量生成NADH， 通过直接或间接的定量NADH，可以定量样品中的L-苏氨酸浓度。通过本发明的方法，可 以通过单个步骤进行分析。或者也可以在上述酶促反应中定量从L-苏氨酸生成的2-氨 基-3-氧代丁酸来定量L-苏氨酸浓度。
【附图说明】
[0066] 图1:图1示出了来源于钩虫贪铜菌NBRC102504的TDH的SDS-PAGE。泳 道:M，分子量标准s;1，无细胞提取液；2,硫酸鱼精蛋白；3, 30-60 %硫酸铵级分；4， DEAE-T0Y0PEARL;5, 丁基-T0Y0PEARL;6,Gigapite;7,Superdex-G200〇
[0067] 图2 :图2示出了TDH的分子量确定结果。标准蛋白质（?），TDH(〇）。
[0068] 图3 :图3示出了TDH在不同pH下的活性。（A):乙酸钠缓冲液（pH5. 0-6. 0); (▲):磷酸钾缓冲液（pH6. 0-7. 5) ; ( □ ):HEPES缓冲液（pH7. 0-8. 0) ; ( ) :Tris-HCl缓 冲液（pH7. 5-9. 0);(〇）：Na2C03-NaHC03缓冲液（pH9. 0-11. 5) ; ( ?):甘氨酸-KC1-K0H 缓冲液（pH10. 0-12. 0)。
[0069] 图4 :图4示出了在各种缓冲液中的IDH的pH稳定性。（A):乙酸钠缓冲 液（pH4. 0-6. 0) ; ( ▲):磷酸钾缓冲液（pH6. 0-7. 5) ; ( □ )，Tris-HCl缓冲液（pH 7. 0-9. 0);(〇），Na2C03-NaHC03缓冲液（pH9. 0-11. 0) ; ( ?)，甘氨酸-KC1-K0H缓冲液（pH 10. 0-12. 0)〇
[0070] 图5 :图5示出了pH对TDH活性的影响。
[0071] 图6 :图6示出了温度对酶稳定性的影响。
[0072] 图7 :图7示出了本发明的TDH对L-苏氨酸的LineweaverBurk作图。
[0073] 图8 :图8不出了本发明的TDH对NAD+的LineweaverBurk作图。
[0074] 图9 :图9示出了本发明的IDH的基因序列和氨基酸序列。
[0075] 图10 :图10示出了从含有CnTDHpET15b质粒的大肠杆菌纯化的TDH-His的 SDS-PAGE。泳道M:低分子量标记物；泳道1 :大肠杆菌BL21 (DE3)的无细胞提取液；泳道 2 :来自大肠杆菌BL21(DE3)的CnTDH-His的无细胞提取液；泳道3 :纯化的基因重组的 TDH-His酶。
[0076] 图11 :图11示出了使用TDH对L-苏氨酸的酶定量的标准曲线。
[0077] 图12 :图12示出了人血液中的L-苏氨酸浓度的测量结果。使用IDH的酶的微量 滴定板测定（□)、通过UPLC的定量（)。样品：A，人血清A;B，人血清B;C，人汇合血清； D，人血浆D;E，人血浆E;F，人汇合血浆。
[0078] 图13 :图13示出了向人血浆中添加已知量的IDH时，L-苏氨酸酶的定量结果。
[0079] 发明的【具体实施方式】
[0080] L-苏氨酸脱氢酶
[0081]L-苏氨酸脱氢酶（TDH;EC1. 1. 1. 103)是在微生物和动物中异化L-苏氨酸的重 要的关键酶（参考文献1，2)。TDH催化L-苏氨酸到2-氨基-3-氧代丁酸的氧化反应。 2_氨基-3-氧代丁酸经过非酶促的脱羧反应，分解为氨基丙酮和二氧化碳。再通过CoA-依 赖性的2-氨基-3-氧代丁酸CoA裂合酶（EC2. 3. 1. 29)的作用将氨基丙酮分解为甘氨酸和 乙酰-CoA(参考文献3)。
[0082]【化学式1】
[0083]
【主权项】
1. L-苏氨酸分析用酶制剂，其包含来源于钩虫贪铜菌的L-苏氨酸脱氢酶。
2. 权利要求1记载的L-苏氨酸分析用酶制剂，其中，所述钩虫贪铜菌是钩虫贪铜菌 NBRC 102504。 3. L-苏氨酸分析用酶制剂，其包含具有下述（1) - (3)中的任一氨基酸序列且具有L-苏 氨酸脱氢酶活性的蛋白质： (1) 序列表的序列号1记载的氨基酸序列； (2) 在序列表的序列号1记载的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加1~15个氨基酸 而得到的氨基酸序列； (3) 相对于序列表的序列号1记载的氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序 列。 4. L-苏氨酸分析用酶制剂，其包含来源于钩虫贪铜菌的L-苏氨酸脱氢酶，其具有以下 物理性质和特性： 分子量（SDS-PAGE和凝胶过滤色谱）：79400 亚基分子量（SDS-PAGE) :37200 最适 pH :10. 0 最适温度：75 °C 底物特异性：仅对L-苏氨酸显示出活性 辅酶：NAD+ (对NADP+为非活性） 抑制剂：被碘乙酰胺、PMS、NEM抑制。
5. -种L-苏氨酸分析用试剂盒，其包含下述的（A)或（B): (A) 来源于钩虫贪铜菌的L-苏氨酸脱氢酶或者具有下述（1)-(3)中的任一氨基酸序列 且具有L-苏氨酸脱氢酶活性的蛋白质，和 (B) 辅酶 NAD+; (1) 序列表的序列号1记载的氨基酸序列； (2) 序列表的序列号1记载的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加1~15个氨基酸而 得到的氨基酸序列； (3) 相对于序列表的序列号1记载的氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序 列。
6. 权利要求5记载的试剂盒，其中，所述钩虫贪铜菌是钩虫贪铜菌NBRC 102504。
7. 权利要求6记载的试剂盒，其还包括用于分析NADH的量的色素和/或酶。 8. L-苏氨酸分析用酶制剂，其是通过使缓冲液中包含来源于钩虫贪铜菌的L-苏氨酸 脱氢酶或具有下述（1)-(3)中的任一氨基酸序列且具有L-苏氨酸脱氢酶活性的蛋白质而 成的： (1) 序列表的序列号1记载的氨基酸序列； (2) 在序列表的序列号1记载的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加1~15个氨基酸 而得到的氨基酸序列； (3) 相对于序列表的序列号1记载的氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序 列。
9. 权利要求8记载的酶制剂，所述钩虫贪铜菌是钩虫贪铜菌NBRC102504。
10.用于定量L-苏氨酸的酶传感器，其特征在于，在检测用电极上直接或间接地固定 或布置了来源于钩虫贪铜菌的L-苏氨酸脱氢酶或具有下述（1)-(3)中的任一氨基酸序列 且具有L-苏氨酸脱氢酶活性的蛋白质： (1) 序列表的序列号1记载的氨基酸序列； (2) 在序列表的序列号1记载的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加1~15个氨基酸 而得到的氨基酸序列； (3) 相对于序列表的序列号1记载的氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序 列。
【专利摘要】本发明提供了包含在被分析物中的L-苏氨酸的分析方法，将含有被分析物的样品与来源于钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)的L-苏氨酸脱氢酶以及辅酶NAD+混合，经过预定的时间后，分析NADH的量或2-氨基-3-氧代丁酸的量；可用于该分析方法中的新型L-苏氨酸脱氢酶(TDH；EC 1.1.1.103)——来源于钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)的L-苏氨酸脱氢酶；用于制备该酶的基因等和酶的制备方法；还提供了包括(A)上述L-苏氨酸脱氢酶和(B)辅酶NAD+的用于分析L-苏氨酸脱氢酶的试剂盒，其是在缓冲液中含有上述L-苏氨酸脱氢酶且用于分析L-苏氨酸脱氢酶的酶制品；使用上述L-苏氨酸脱氢酶的酶传感器。
【IPC分类】C12Q1-32, C12N9-06
【公开号】CN104830958
【申请号】CN201510097853
【发明人】浅野泰久, T.尤特农奇特
【申请人】富山县, 味之素株式会社
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2011年3月4日
【公告号】CN102834516A, US8785147, US20130052679, WO2011108727A1