一种长效重组人脑钠肽融合蛋白及其制备方法与用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学和医药领域。更具体地，本发明涉及一种长效重组人脑钠 肽融合蛋白及其制备方法与用途。
【背景技术】
[0002] 随着人口老龄化进程的加快及高血压、冠心病等心血管疾病发病率的上升，心力 衰竭的发病率、死亡率也逐年增加。目前欧洲近10亿人口，至少有1500万心衰患者；根据 中国心血管病报告2011指出，我国目前有心衰患者约420万人。人群中心衰的患病率约为 1. 5 %~2. 0 %，随着年龄增加，其发病率也在增加，75岁以前为2-3 %，75-80岁的发病率为 10-20%。在过去的40年中，心衰导致的死亡增加了 6倍，年均心衰死亡率已达到30-50 %。 心衰的预后极差，5年生存率与恶性肿瘤相仿。我国五十家医院住院病例调查报告显示，心 力衰竭住院率占同期心血管病的20% ;死亡率占40%。
[0003] 心衰的治疗，一方面应该通过强心、利尿、扩血管来改善症状，另一方面应该抑制 神经内分泌系统过度激活、改善心室重构以消除慢性心衰的发病基础。目前治疗心衰的 常用药物主要包括利尿剂、血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI)/血管紧张素 II受体拮抗剂 (ARB)、β受体阻滞剂、醛固酮受体拮抗剂和洋地黄类药物。虽然，这些常规药物对改善心 衰症状起到了良好的作用，但是心衰患者的总体预后仍较差，其产生的副作用主要表现在 药物耐受性、心动过速及其它心律失常、低血压、以及激活与心力衰竭病理过程有关的神经 激素-血管紧张素系统。因此，为了更有效地治疗心衰、逆转心室重构、改善患者的预后、提 高患者生存期，新型药物的研宄也不断地发展。目前已获得指南推荐的治疗新药有伊伐布 雷定、奈西利肽、左西孟旦以及托伐普坦等，为一系列的循证医学提供了依据。
[0004] 奈西立肽，又称重组人脑利钠肽（rhBNP)，用于治疗急性充血性心衰，属内源性激 素物质，与人心室肌分泌的天然BNP具有相同的32个氨基酸序列（如下式）。
[0005] Ser Pro Lys Met Val GlnGlySerGlyCysPheGlyArg Lys Met Asp Arg He SerSer
[0006] SerSerGlyLeuGlyCys Lys Val LeuArgArg His
[0007] 奈西立肽氨基酸序列
[0008] hBNP与血管平滑肌和内皮细胞上的鸟苷酸环化酶受体结合，引起细胞内第二信 使环单磷酸鸟苷（cGMP)的水平升高，从而引发一系列生理效应：（1)具有内皮非依赖性的 血管舒张活性，扩张动静脉，降低全身血管阻力、充盈压以及肺毛细血管嵌楔压（pulmonary capillarywedge pressure，PCWP)，降低心脏前后负荷；（2)提高肾小球滤过率，产生排钠利 尿作用，降低体液负荷，提高心排血量，综合性改善心脏功能；(3)在体内抑制肾素-血管紧 张素-醛固酮系统（RAAS)的激活，抑制由于扩血管效应引起的反射性心率增加，避免心律 失常的发生；(4)抑制血管内皮细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞的生长，对心肌肥厚有抑制 作用。因此，rhBNP有利于减轻心衰患者的呼吸困难程度和全身症状，不同于以前单一的血 管扩张药物或利尿剂，是一个具有多种治疗作用的药物。但是，目前临床应用的rhBNP由于 体内半衰期短（仅为18min)，须频繁给药才能达到治疗目的，影响患者用药的顺应性，进而 影响了产品在临床上的广泛应用。
[0009] 本发明从解决现有rhBNP半衰期短的不足出发，通过将rhBNP与人IgG4Fc片段绞 链区中的半胱氨酸（Cys)残基连接，形成类似IgG4、但缺少CHl区域和轻链的rhBNP-Fc融 合蛋白从而达到延长rhBNP的循环半衰期/增加生物活性，并达到延长药物有效时间、减少 药物副作用等目的。
【发明内容】
[0010] 本发明的第一个目的在于提供一种长效重组人脑钠肽融合蛋白（Human Brain Natriumretic-Fc fusion protein，重组 hBNP-Fc 融合蛋白，简称 hBNP-Fc)，所述 hBNP-Fc 具有半衰期长、生物活性高等有益效果。
[0011] 本发明的上述有益效果通过以下技术方案实现：一种重组hBNP-Fc融合蛋白，其 特征在于所述的融合蛋白其单链的氨基酸序列从N端到C端依次包含人BNP (hBNP)、肽接头 和人IgG4Fc变体。
[0012] 具体的，所述融合蛋白为二聚化融合蛋白（如图Ib所示），所述的人IgG4Fc变体 为
[0013] 含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域。IgG4Fc变 体CH2区域在228、235 (由EU编号体系确定的位置）含有氨基酸突变，有利于维持IgG4的 空间结构以及降低Fc的效应子功能，并且在纯化融合蛋白时有助于获得均匀完整的制备 物（美国专利 No. 6, 797, 493、6, 900, 292、6, 204, 007)。
[0014] 所述的肽接头含有2-20个氨基酸，存在于hBNP和人IgG4Fc变体之间，且所述的 肽接头含有两个或更多选自甘氨酸（Gly)和苏氨酸（Thr)的氨基酸。优选的，所述肽接头 的氨基酸序列如SEQ ID NO. :2所示。
[0015] 所述的重组hBNP-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. :4所示。
[0016] IgG类的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质。本发明采用的IgG4Fc片段与 hBNP融合，可增强hBNP生物活性，并对hBNP蛋白具有稳定作用，而所得融合蛋白具有较低 的抗体依赖细胞毒性（Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxic，ADCC)和补体依赖 细胞毒性（Complement Dependent Cytotoxicity，CDC)活性，副作用较小。
[0017] 本发明的第二个目的在于提供了一种与本发明重组hBNP-Fc融合蛋白相匹配的 制备方法，该制备方法包含如下步骤：
[0018] (1)构建编码重组hBNP-Fc融合蛋白的基因表达载体；
[0019] (2)构建高表达重组hBNP-Fc融合蛋白的工程细胞株；
[0020] (3)批次流加培养工程细胞株，以表达重组hBNP-Fc融合蛋白；
[0021] (4)重组hBNP-Fc融合蛋白的分离纯化。
[0022] 具体的，所述步骤（1)的具体步骤为：采用人工合成方法获得编码重组hBNP-Fc融 合蛋白基因的核苷酸序列（如SEQ ID NO. :3所示，包含前导肽序列），插入到哺乳动物细 胞表达载体，获得含有hBNP-Fc目的基因的表达质粒（如图3所示）。
[0023] 所述的哺乳动物细胞表达载体可采用但不限于市售的如：p⑶NA3. 1(+)、pCMV/ ZEO、pIRES、pDR、pBK、pSPORT等可用于真核细胞系统表达的载体，优选的，所述哺乳动物细 胞表达载体为PCDNA3. 1 (+)。
[0024] 所述步骤⑵的具体步骤为：将步骤⑴所得含有hBNP-Fc目的基因的表达质粒 转染到合适的哺乳动物宿主细胞，并筛选获得稳定、高表达目的融合蛋白的细胞株。
[0025] 所述的哺乳动物宿主细胞包括CHO、HEK293、COS、BHK、NSO、Sp2/0细胞。优 选的，所述哺乳动物宿主细胞为CHO细胞；更优选的，所述哺乳动物宿主细胞为 DHFR(DihydrofolateReductase，二氢叶酸还原酶）缺陷型 CHO 细胞（简称 CHO-DHFIT)。
[0026] 所述的转染方法选自磷酸钙法、电穿孔转染法、脂质体转染法，优选电穿孔转染 法。
[0027] 所述的筛选稳定、高表达目的融合蛋白的细胞株的方法为：先利用筛选标记进 行筛选，然后用扩增选择性标记可提高表达量并获得稳定高表达哺乳动物细胞株。所述 筛选标记是本领域内已知的任何一种合适的选择性抗性标记，如ZE0(Zeocin，博来霉 素 ）、NEO (Neomycin,新霉素）、PUR(puromycin,嗓呤霉素 ）、HYP (Hygromycin,潮霉素）， 优选NEO ;所述筛选标记也可为本领域内已知的任何一个荧光标记基因，包括GFP (Green Fluorescent Protein，绿色焚光蛋白）、RFP (RedFluore