得的重组原核表达载体质粒转化至大肠杆菌原核表达菌株BL21(DE3)中， 获得Q9SMJ4蛋白大肠杆菌原核表达体系菌液；
[0044] f.将步骤e中组建的表达体系菌液按比例（v/v) 1:100接种到LB液体培养基中并 装入两倍体积于液体培养基锥形瓶中进行培养；
[0045] g.将步骤f中的培养菌液进行Q9SMJ4蛋白诱导表达；
[0046] h. 4800~5000rpm，4°C离心5~IOmin收集诱导结束菌液中的菌体，弃上清。
[0047] 其中，步骤f中培养条件优选在37°C，转速200rpm的培养箱中进行培养6h，待菌 液OD值达到0. 6~0. 8。
[0048] 步骤g中具体诱导表达条件优选为：诱导温度为37°C，抗生素 Kan浓度为25 μ g/ mL，诱导表达时间为6h，诱导剂IPTG浓度为0. 5mM，摇床转速为200rpm。
[0049] 作为本发明方法的一种优选，步骤（2)原核表达可溶性蛋白纯化进一步包括：
[0050] a.每50mL培养菌液收集的菌体用缓冲液IOmL重悬菌体，并加入170 μ L 35%的 TritonX-IOO 和 100 μ L IOOmM 的 PMSF ;
[0051] b.将重悬菌液置于冰上，超声破碎直至菌液变得澄清透明，超声条件为超声破碎 3s，冷却5s，功率为400瓦特；
[0052] c.将超声破碎过的菌液12000rpm，4°C离心15min，收集上清，弃沉淀；
[0053] d.将含有His标签蛋白的上清液加入Ni柱中，控制流速0. 5-1. OmL/min，直至上 清液完全流过Ni柱，上样量/柱体积（v/v)比例最大为15:1 ;
[0054] e.用8倍柱体积的缓冲液2冲洗Ni柱或直至A28tl值达到稳定，流速控制为1.0 mL/ min ；
[0055] f.洗脱His标签表达蛋白采用梯度洗脱方式，每一梯度洗脱体积为4个柱体积，收 集各个梯度洗脱蛋白；
[0056] g.通过SDS-PAGE电泳检测上一步中各洗脱梯度洗脱蛋白纯度，确定收集成份单 一、杂质较少且蛋白分子量与目的蛋白相符合的蛋白洗脱组分；
[0057] h.将收集的洗脱蛋白液装入截留分子量为3600Da的透析袋中，放入超纯水中透 析24h除盐，期间晃动透析袋并更换超纯水；
[0058] i.将透析结束的透析袋放入40% (w/v)的PEG 6000溶液中浓缩至适当体积，即 为原核表达并纯化收集的Q9SMJ4可溶性蛋白溶液。
[0059] 其中，所述的缓冲液1为50mM NaH2P04、300mM NaCl，pH = 8. 0 ;所述的缓冲液2 为 50mM NaH2P04、300mM NaClUOmM 咪唑，pH = 8· O ;步骤 f 使用的洗脱液为 50mM NaH2P04、 300mM NaCl，pH = 8· 0,咪唑浓度分别为 50、100、150、200、250mM。
[0060] 作为本发明方法的一种优选，步骤（3)原核表达包涵体蛋白纯化及蛋白复性进一 步优选包括：
[0061] a.每50mL培养菌液收集的菌体用pH = 8. 0、0.1 M磷酸缓冲液IOmL重悬菌体；
[0062] b.将重悬菌液置于冰上，超声破碎直至菌液变得澄清，超声条件为超声破碎3s， 冷却5s，功率为400瓦特；
[0063] c.将超声破碎过的菌液12000rpm，4°C离心10min，收集沉淀，弃上清；
[0064] d.用pH = 8. 0、0· IM磷酸缓冲液洗涤沉淀一次，12000rpm，4°C离心10min，收集沉 淀；
[0065] e.用IOmL溶解液溶解沉淀，在室温下孵育l_2h，期间不断摇晃溶液，使沉淀溶解 完全；
[0066] f. 12000rpm，4°C条件下离心30min，收集上清液，弃沉淀不溶物；
[0067] g.用8倍柱体积缓冲液3平衡Ni柱，控制流速为0. 5-1. OmL/min ;
[0068] h.将步骤f中收集到的含有His标签蛋白的上清液加入Ni柱中，控制流速 0. 5-1. OmL/min，直至上清液完全流过Ni柱，上样体积：柱体积比例最大为15:1 ;
[0069] i.用4倍柱体积缓冲液3再次平衡Ni柱，控制流速0. 5-1. OmL/min ;
[0070] j.用2倍柱体积的缓冲液4冲洗Ni柱或直至A28tl值达到稳定，流速控制为1.0 mL/ min ；
[0071] k.用6倍柱体积的缓冲液5洗脱包涵体蛋白流速控制为1.0 mL/min ;
[0072] I. SDS-PAGE电泳检测上一步中洗脱蛋白纯度及纯化效果；
[0073] m.在4°C条件下将洗脱收集到的包涵体蛋白自然复性，向溶液中慢慢加入超纯 水，使溶液中脲浓度进行梯度稀释；
[0074] η.将复兴结束的蛋白溶液装入截留分子量为3600Da的透析袋中，放入超纯水中 透析24除盐，期间晃动透析袋并更换超纯水；
[0075] 〇·将透析结束的透析袋放入40% (w/v)的PEG 6000溶液中浓缩至适当体积，即 为原核表达纯化收集并复性的Q9SMJ4包涵体蛋白溶液。
[0076] 其中，所述的溶解液为 IOOmM NaH2P04、IOmM Tris-HCl、IOOmM DTT、8M 脲，pH = 8. 0 ;所述的缓冲液3为IOOmM NaH2PO4UOmM Tris-HC1、8M脲，pH = 8. 0 ;所述的缓冲液4 为 IOOmM NaH2PO4UOmM Tris-HC1、8M 脲、IOmM 咪唑，pH = 8. 0 ;所述的缓冲液 5 为 IOOmM NaH2P04、10mM Tris-HC1、8M 脲、200mM 咪唑，pH = 8. 0〇
[0077] 步骤m中脲浓度进行稀释的梯度优选为8M-6M-4M-2M-1M-0. 1M，每一梯度持续时 间
[0078] 为 lh。
[0079] 本发明方法整个过程的溶液配制均需用纯水。
[0080] 有益效果
[0081] 本发明针对一种存在于鹰嘴豆籽粒中的贮藏蛋白类型α-淀粉酶抑制剂从天然 材料中难以分离纯化，去除其他杂蛋白成为此α-淀粉酶应用于实际的挑战难题，首次建 立一套适合于此贮藏蛋白类型α-淀粉酶抑制剂的生产及纯化工艺流程。
[0082] 本套生物工艺流程首次对鹰嘴豆籽粒中此贮藏蛋白类型α -淀粉酶抑制剂进行 了生物制备及后续的蛋白纯化回收，经SDS-PAGE电泳检测分离得到的制备蛋白活性高，制 备量多，操作简便，成本较低，重复性好，可直接应用于此α -淀粉酶抑制剂的生物生产。
[0083] 整个生产工艺流程同样分别适用于Q9SMJ4蛋白alpha链（采用编码alpha链的 0RF)和beta链（采用编码beta链的0RF)的生产和纯化，也可应用于不同生物（动物、植 物、微生物）来源的、具有Cupin结构（功能域）的贮藏蛋白类型α-淀粉酶抑制剂的生产 和纯化。
【附图说明】
[0084] 图I Q9SMJ4蛋白序列及alpha和beta肽链序列信息图
[0085] 图2鹰嘴豆籽粒中贮藏蛋白类型α -淀粉酶抑制剂（Q9SMJ4)原核表达可溶性蛋 白表达及纯化结果图
[0086] 红色框内所示为表达蛋白条带，从右至左泳道依次为：1.蛋白maker，2.表达菌破 碎上清液，3.表达菌破碎沉淀物，4.样品穿透峰，5.洗脱峰（IOmM咪唑），6.洗脱峰（50mM 咪唑），7.洗脱峰（IOOmM咪唑），8.洗脱峰（150mM咪唑），9.洗脱峰（200mM咪唑），10.洗 脱峰（250mM咪唑）
[0087] 图3鹰嘴豆籽粒中贮藏蛋白类型α -淀粉酶抑制剂（Q9SMJ4)原核表达包涵体蛋 白表达及纯化结果图
[0088] 红色箭头所示为贮藏蛋白类型α -淀粉酶抑制剂（Q9SMJ4)原核表达包涵体蛋白
【具体实施方式】
[0089] 实施例1
[0090] (1)原核表达体系构建及菌液培养诱导表达：
[0091] a.以Desi型鹰嘴豆发育中种子的cDNA为模板，通过PCR方法获得编码α-淀粉 酶抑制剂蛋白（其在NCBI中编号为Q9SMJ4)的ORF序列，引物序列为
[0092] Fl:5,-TGTCATCATGGCTAAGCTTCTTG-3,（SEQ ID NO. 1)和
[0093] Rl:5'-TTGTTTCCGCTAAAAGGTACATG-3'（SEQ ID NO. 2);
[0094] b.利用PCR技术在编码Q9SMJ4蛋白ORF序列（去除编码蛋白信号肽序列）的5' 和3'端分别添加限制性酶切位点序列EcoR I和Not I，获得目的基因片段，引物序列为
[00