95] F2:5'-CGGAATTCTTGAGAGATCAACCT-3, (SEQ ID NO. 3)和
[0096] R2:5,-TTTTCCTTTTGCGGCCGCCAGCTGCTGCTTTGTT-3' (SEQ ID NO. 4)；
[0097] c.利用限制性内切酶EcoR I和Not I对步骤b中获得的目的基因片段在37°C 条件下进行4个小时酶切处理，胶回收处理过的DNA片段；
[0098] d.利用限制性内切酶EcoR I和Not I对pET_28a(+)原核表达载体质粒进行 37°C条件下酶切4小时，胶回收处理过的质粒DNA片段；
[0099] e.将步骤c和步骤d中获得的已用限制性内切酶处理过的DNA片段用T4连接酶 在16°C条件下连接，获得重组原核表达载体；
[0100] f.将获得的重组原核表达载体质粒转化至大肠杆菌原核表达菌株BL21(DE3)中， 获得Q9SMJ4蛋白大肠杆菌原核表达体系菌液；
[0101] g.将步骤f中组建的表达体系菌液按比例（v/v) 1:100接种到LB液体培养基中并 装入两倍体积于液体培养基锥形瓶中，在37°C，转速200rpm的培养箱中进行培养6h，待菌 液OD值达到0. 7左右；
[0102] h.将步骤g中的培养菌液进行Q9SMJ4蛋白诱导表达，具体诱导表达条件如下： 诱导温度为37°C，抗生素 Kan浓度为25 μ g/mL，诱导表达时间为6h，诱导剂IPTG浓度为 0. 5mM，转速为 200rpm ;
[0103] i. 5000rpm，4°C离心5min收集诱导结束菌液中的菌体，弃上清。
[0104] (2)原核表达可溶性蛋白纯化方法：
[0105] a.每50mL培养菌液收集的菌体用缓冲液I (50mM NaH2PO4、300mM NaCl，pH = 8.0) IOmL 重悬菌体，并加入 170 μ L 35 % 的 TritonX-100 和 100 μ L IOOmM 的 PMSF ;
[0106] b.将重悬菌液置于冰上，超声破碎直至菌液变得澄清透明，超声条件为超声破碎 3s，冷却5s，功率为400瓦特；
[0107] c.将超声破碎过的菌液12000rpm，4°C离心15min，收集上清，弃沉淀；
[0108] d.将含有His标签蛋白的上清液加入Ni柱中，控制流速0. 5-1. OmL/min，直至上 清液完全流过Ni柱，上样量：柱体积比例最大为15:1 ;
[0109] e.用 8 倍柱体积的缓冲液 2(50mM NaH2P04、300mM NaClUOmM 咪唑，pH = 8. 0)冲 洗Ni柱或直至A28c!值达到稳定，流速控制为1.0 mL/min ;
[0110] f.洗脱His标签表达蛋白采用梯度洗脱方式，洗脱液为50mM NaH2P04、300mM NaCl，pH = 8. 0,咪唑浓度分别为50、100、150、200、250mM，每一梯度洗脱体积为4个柱体积， 收集各个梯度洗脱蛋白；
[0111] g.通过SDS-PAGE电泳检测步骤f中各洗脱梯度洗脱蛋白纯度，确定适合收集的洗 脱组分；
[0112] h.将收集的洗脱蛋白液装入截留分子量为3600Da的透析袋中，放入超纯水中透 析24h除盐，期间晃动透析袋并更换超纯水；
[0113] i.将透析结束的透析袋放入40% (w/v)的PEG 6000溶液中浓缩至适当体积，即 为原核表达并纯化收集的可溶性Q9SMJ4蛋白溶液。
[0114] j.通过SDS-PAGE胶检测收集到的可溶性Q9SMJ4蛋白（图2)，所示原核表达菌表 达可溶性蛋白较高，纯化效果良好，具有较高的活性，纯化回收蛋白含量较高。
[0115] 实施例2
[0116] a. 5000rpm，4°C离心5min收集实施例1步骤（1)诱导结束菌液中的菌体，弃上清；
[0117] b.每50mL培养菌液收集的菌体用0.1 M磷酸缓冲液（pH = 8. 0) IOmL重悬菌体；
[0118] c.将重悬菌液置于冰上，超声破碎直至菌液变得澄清，超声条件为超声破碎3s， 冷却5s，功率为400瓦特；
[0119] d.将超声破碎过的菌液12000rpm，4°C离心10min，收集沉淀，弃上清；
[0120] e.用0· IM磷酸缓冲液（pH = 8. 0)洗涤沉淀一次，12000rpm，4°C离心10min，收集 沉淀；
[0121] f.用 IOmL 溶解液（IOOmM NaH2PO4UOmM Tris-HCl、IOOmM DTT、8M 脲，pH = 8.0) 溶解沉淀，在室温下孵育1-2h，期间不断摇晃溶液，使沉淀溶解完全；
[0122] g. 12000rpm，4°C条件下离心30min，收集上清液，弃沉淀不溶物；
[0123] h.用 8 倍柱体积缓冲液 3 (IOOmM NaH2P04、IOmM Tris-HC1、8M 脲，pH = 8. 0)平衡 Ni柱，控制流速为0. 5-1. OmL/min ;
[0124] i.将步骤g中收集到的含有His标签蛋白的上清液加入Ni柱中，控制流速 0. 5-1. OmL/min，直至上清液完全流过Ni柱，上样体积：柱体积（v/v)比例最大为15:1 ;
[0125] j.用 4 倍柱体积缓冲液 3 (IOOmM NaH2P04、IOmM Tris-HC1、8M 脲，pH = 8. 0)再次 平衡Ni柱，控制流速0. 5-1. OmL/min ;
[0126] L 用 2 倍柱体积的缓冲液 4 (IOOmM NaH2P04、IOmM Tris-HCl、8M 脲、IOmM 咪唑，pH =8. 0)冲洗Ni柱或直至A280值达到稳定，流速控制为1.0 mL/min ;
[0127] 1.用 6 倍柱体积的缓冲液 5(100mM NaH2PO4UOmM Tris-HC1、8M脲、200mM咪唑，pH =8. 0)洗脱包涵体蛋白流速控制为1.0 mL/min ;
[0128] m. SDS-PAGE电泳检测上一步中洗脱蛋白纯度及纯化效果；
[0129] η.在4°C条件下将洗脱收集到的包涵体蛋白自然复性，向溶液中慢慢加入超纯 水，使溶液中脲浓度进行梯度稀释（8M-6M-4M-2M-1M-0. 1M)，每一梯度持续时间为Ih ;
[0130] 〇.将复性结束的蛋白溶液装入截留分子量为3600Da的透析袋中，放入超纯水中 透析24h除盐，期间晃动透析袋并更换超纯水；
[0131] p.将透析结束的透析袋放入40%的PEG 6000溶液中浓缩至适当体积，即为原核 表达纯化收集并复性的Q9SMJ4包涵体蛋白溶液。
[0132] y.经过SDS-PAGE胶检测收集的Q9SMJ4蛋白包涵体（图3)，所示效果为原核表达 菌表达目的蛋白量很高，诱导表达条件良好，纯化回收效果良好，具有较高的活性，纯化回 收蛋白含量较高，杂蛋白含量极少。
【主权项】
1.一种具有Cupin结构功能域的贮藏蛋白类型a-淀粉酶抑制剂的生产和纯化方法， 其特征在于包括以下步骤（1)和选自步骤（2)和步骤（3)中的一项或两项： (1) 原核表达体系构建及菌液培养诱导表达： 将目的蛋白的ORF克隆至原核表达载体，并构建Q9SMJ4蛋白大肠杆菌原核表达体系； 培养Q9SMJ4蛋白大肠杆菌原核表达体系，并诱导目的蛋白表达；其中所述的原核表达载体 含有His标签蛋白编码基因； (2) 原核表达可溶性蛋白纯化： a. 每50mL培养菌液收集的菌体用IOmL缓冲液1重悬菌体，，并加入150~200 y L 35% 的 TritonX-IOO 和 50 ~100 y L IOOmM 的 PMSF; b. 将重悬菌液置于冰上，超声破碎菌体； c. 将超声破碎过的菌液离心，收集上清，弃沉淀； d. 将含有His标签蛋白的上清液加入Ni柱中，控制流速0. 5-1. OmL/min，直至上清液 完全流过Ni柱； e. 用6~10倍柱体积的缓冲液2冲洗Ni柱或直至A28tl值达到稳定； f. 洗脱His标签表达蛋白采用梯度洗脱方式，每一梯度洗脱体积为4~5个柱体积，收 集各个梯度洗脱蛋白； g. 通过SDS-PAGE电泳检测上一步中各洗脱梯度洗脱蛋白纯度，确定适合收集的洗脱 组分； h. 将收集的洗脱蛋白液装入截留分子量为3600Da的透析袋中，放入超纯水中透析 20~24h除盐，期间晃动透析袋并更换超纯水； i. 将透析结束的透析袋放入40% (w/v)的PEG 6000溶液中浓缩至适当体积，即为原 核表达并纯化收集的目的可溶性蛋白溶液； (3) 原核表达包涵体蛋白纯化及蛋白复性： a. 每50mL培养菌液收集的菌体用0.1 M磷酸缓冲液IOmL重悬菌体； b. 将重悬菌液置于冰上，超声破碎菌体； c. 将超