后续研宄是在毕赤酵母中进行表达，采用的载体中有更适合外源基因在酵母中分泌的信号肽，所以我们去掉信号肽序列，剩下编码成熟猪α干扰素的基因序列，其核苷酸长度为501bp;将猪α干扰素的编码密码子与毕赤酵母偏好密码子进行比对，根据密码子的兼并性，在不改变氨基酸组成和排列顺序的基础上，对已知的编码猪α干扰素的基因序列进行改造，替换为毕赤酵母喜好的密码子，旨在提高基因在毕赤酵母的表达水平；
然后将替换后的序列5'、3;端分别加上EcoR1、XbaI酶切位点，送上海生工生物公司进行全基因合成，并连入真核表达质粒PGAPZaA中，得到重组真核表达质粒pGAPZa A-1FN-α 。
[0012](二)猪α干扰素的真核表达
(1)重组质粒pGAPZa A-1FN-α采用BspHI酶切酶线性化；
(2)将测序正确的重组质粒pGAPZαΑ-1FN-α线性化后转入毕赤酵母Χ_33，挑取单菌落进行PCR鉴定，PCR采用引物F1/F2，
以 5’ -GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3’ 为上游引物；
以 5’ -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’ 为下游引物；
PCR总体积为25 yL，其中2.5 yL buffer，IyL dNTP，上游引物0.5 μ L，下游引物
0.5yL，毕赤酵母Χ-33 I μ L，Taq 0.1 μ L，ddH20 19.4 μ L ;其中，上下游引物的浓度均为10 ymol/L ；dNTP 的浓度为 10 mmol/L。
[0013]反应条件为以95°C 5min，95°C lmin，55°C lmin，72°C 80s 为一个循环，经过 30个循环，最后72°C延伸lOmin，得到大小约900bp的目标条带；
(3)挑取YPD平板上X33菌株分别接种进入20ml液体YPD培养基，30°C，250r/m培养至OD=L 3、1.4或1.5。按I %的比例将菌液接种于液体YPD培养基中，30°C，250r/m培养36h后取样1ml，之后每隔12h取样，把上述样品进行SDS-PAGE电泳，以确定最佳表达时间。其中，YPD培养基包括1%酵母膏、2%蛋白胨和2%葡萄糖。
[0014]试验结果表明:挑取的9株菌PCR检测显示为阳性，大小(约900bp)和理论值一致，如图1所示(其中，M表示DNA标准Mark ；A表示阳性对照，为pGAPZ a A-1FN- α质粒；1-9表示编号1-9的菌株PCR结果)，该工程菌采用pGAPZ a A质粒，不需甲醇诱导，只需采用含葡萄糖的培养基即可表达干扰素，其不同发酵时间的SDS-PAGE结果如图2所示(Μ表示蛋白质标准Mark ;1表示发酵36h的上清液；2表示发酵48h的上清液；3表示发酵60h的上清液；4表示发酵72h的上清液。)，在72h表达量最高，所以最佳的发酵时间为72h。
[0015]将上述复合猪α干扰素进行效价测定，过程如下:
工程菌发酵72h后，4°C，8000rpm离心15min收集上清，取上清液用0.22 μ m孔径的滤膜过滤除菌，采用细胞病变抑制法在猪肾细胞-水疱性口炎病毒系统上测定猪α干扰素的抗病毒活性。在96孔板上每孔加入2倍倍比稀释的猪α-干扰素50 μ L(用细胞培养液稀释)，再加入猪肾细胞1.8Χ 106-2.2X 16个/mL的悬液50 μ L，在37°C、5% CO 2条件下孵育约24小时后，吸去含猪α -干扰素的细胞培养液，每孔加入100 μ L含100个TCID5tl的VSV病毒稀释液。同时设立病毒对照孔(只加同样剂量的病毒，不加干扰素)和细胞对照孔(只加细胞培养液，不加干扰素)。37°C、5% CO2条件下培养24小时后，待病毒对照孔的细胞病变90%-100%时观察结果。用以上方法分别测定未经过序列优化的天然猪α干扰素和经过序列优化复合猪α干扰素的表达产物，比较其效价。
[0016]实验结果表明:未经过序列优化的天然猪α -干扰素效价为1.3Χ 105U/mL，而经过序列优化的复合猪α -干扰素效价为6.5Χ 106U/mL,效价差别为50倍。
[0017]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作出的简单修改，等同变化与改型，仍属于本发明权利要求的保护范围。
【主权项】
1.一种复合猪α干扰素基因，其特征在于:其DNA序列如下所示:tgtgacctgccacagactcattccctggcccatactagagccctgagactgctggcccagatgagaagaatctccccattctcctgtctggaccatagaagagacttcggttccccacatgaagccttcggtggtaaccaggtccagaaggcccaggccatggccctggtccatgaaatgctgcagcagactttccagctgttctccactgaaggttccgccgccgcctgggacgaatccctgctgcatcagttctgtactggtctggaccagcagctgagagacctggaagcctgtgtcatgcaggaagccggtctggaaggtactccactgctggaagaagactccatcctggccgtcagaaagtacttccatagactgactctgtacctgcaggaaaagtcctactccccatgtgcctgggaaatcgtcagagccgaagtcatgagagtcttctcctcctccactaacctgcaggacagactgagaaagaaggaataa0
2.一种如权利要求1所述的复合猪α干扰素基因的合成方法，其特征在于它按照以下步骤顺序进行: (1)登录GeneBank，查找编码猪α干扰素成熟蛋白的基因序列； (2)将猪α干扰素的编码密码子与毕赤酵母Χ-33偏好密码子进行比对，根据密码子的兼并性，将猪α干扰素密码子替换为毕赤酵母Χ-33偏好的密码子； (3)将替换后的序5’、3’端分别加上EcoR1、XbaI酶切位点，进行全基因合成，并连入真核表达质粒pGAPZ a A中，得到重组真核表达质粒pGAPZ a A-1FN- α。
【专利摘要】本发明公开了一种复合猪α干扰素基因，其表达的蛋白与酵母表达的天然猪α干扰素相比，有更好的抗病毒活性，其在猪肾细胞上抵抗100TCID50VSV病毒感染的作用提高了50倍。其合成方法采用毕赤酵母X-33为模板，无需进行另外的添加诱导物，适合工业生产；采用毕赤酵母不会分泌像大肠杆菌表达的外源蛋白那样附带一些对猪体细胞有毒害的毒素，降低了毒性。本发明适用于复合猪α干扰素基因的合成。
【IPC分类】C12N15-81, C12N15-21
【公开号】CN104878016
【申请号】CN201510264341
【发明人】符雷, 郗洪生, 施腾鑫, 田柳
【申请人】江苏恒丰强生物技术有限公司
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年5月22日