[0091] 如下构建菌株 ST724(PYC1~，PYC2~, ura-his-):用质粒 pXI-1-LoxP-KlLEU2-PYCl 〈-PTEF1-PPGK1->PYC2 转化酿酒酵母 CEN. PK102-5B (ura-his-leu-)，在缺乏亮氨酸的 SC 缺 陷培养基上选择转化子并通过对转化子的基因组DNA的PCR来确认质粒的正确整合。菌株 SI724用于通过使用LoxP-Cre介导的重组来去环去除K1LEU2选择性标记从而制备菌株ST 738 (PYC1~，PYC2~，ura-his-leu-) 〇
[0092] 根据表8,用表达质粒转化酵母菌株并在缺乏尿嘧啶、组氨酸和亮氨酸的SC缺陷 培养基上对转化子进行选择。
[0093] 培养菌株并如实施例5中所述那样分析3HP浓度。结果显示在图3中。
[0094] 增加BcBAPAT/EcYdfG或TcPanD的拷贝数使得所有四个测试背景菌株的3HP滴度 改善（参考过表达AAT2、过表达PYC1&PYC2和过表达AAT2&PYC1&PYC2)。多重整合TcPanD 的作用大于多拷贝BcBAPAT/EcYdfG的作用。
[0095] 增加的前体供应（通过过表达PYC1/PYC2和/或AAT2)对具有TcPanD或BcBAPAT/ EcYdfG基因的多个拷贝的菌株中的3HP生产具有积极作用，但是对仅具有后一基因的单个 拷贝的菌株没有积极作用。仅仅在模拟补料分批条件的即时进料培养基中观察到过表达丙 酮酸羧化酶基因的积极作用。在矿物质和即时进料培养基中对于菌株SCE-R2-200(AAT2 t PYC1丨PYC2丨BcBAPAT丨EcYdfG丨TcPanD丨丨）获得的最高滴度分别是：1. 27±0. 28g/L和 8. 51±1. 05g/L。
[0096] 实施例7.利用酵母在pH5的补料分批培养中生产3HP
[0097] 将上述菌株SCE-R2-200的最佳分离物在pH5限制葡萄糖进料的有氧补料分批培 养中培养三份。
[0098] 将SCE-R2-200丙三醇保藏菌（0. 3ml)接种在500ml带挡板摇瓶中的150ml Delft 培养基中并在30°C以250rpm振荡繁殖约24小时。通过以4, OOOxg离心2min，将培养物浓 缩至50ml并用于接种1L-赛多利斯（Sartorius)反应器中的0. 5L培养基。反应器中终培 养基每升包含：15g(NH4)2S04、6g KH2P04、lg MgS04 ? 7H20、4ml痕量金属溶液、2ml维生素溶 液、0. 4ml消泡剂A(Sigma-Aldrich)和44g右旋糖。右旋糖被单独高压灭菌，维生素溶液被 无菌过滤并且在高压灭菌之后添加至培养基。痕量金属和维生素溶液与实施例2中描述的 相同。
[0099] 振荡速度是800rpm，温度为30°C，通风是1L mirT1空气，并且通过自动添加2N Na〇H使pH保持在5. 0。通过声学气体分析仪（型号1311，BruSI & Kjaer )监测排出的气 体中的二氧化碳浓度。一旦葡萄糖耗尽，则以5g 1T1进料，葡萄糖耗尽通过C02产生的下降 观察并且还通过使用葡萄糖试纸Glucose MQuant?(Merck Millipore)检测残留的葡萄糖 来确认。每升进料包含：45g(NH4)2S0 4、18g KH2P04、3g MgS04*7H20、12ml 痕量金属溶液、6ml 维生素溶液、0. 6ml消泡剂A和176g右旋糖。右旋糖被单独高压灭菌，维生素溶液被无菌过 滤并在高压灭菌之后添加至进料。
[0100] 进料开始24小时之后，进料速度提升至10g h 1并在进料开始48小时之后进一步 增加至15g h' -天对反应器取样两次，以测量生物质干重和代谢物。对于代谢物分析，立 即对样品进行离心沉降并将上清液储存在_20°C直到HPLC分析。如实施例5中所描述地进 行葡萄糖、琥珀酸、乙酸酯、3HP、丙三醇、乙醇和丙酮酸的HPLC分析。使用RI-101折射率检 测器Oionex)检测葡萄糖、丙三醇和乙醇。用DAD-3000Diode Array检测器（Dionex)在 210nm检测3HP、丙酮酸、琥珀酸和乙酸酯。
[0101]该菌株以 13. 7±0. 3g ? L-1 滴度、14±0 % C-mol ? C-mol-1 葡萄糖产率和 0. 24±0. 0g? L-1 ? h-1产能生产3-羟基丙酸。在发酵结束时，没有检测到大量的副产物， 如乙酸酯、乙醇或丙三醇。结果显示在图4中。
[0102] 在本说明书中，除非另外明确指出，词语"或"用于指当规定的条件之一或二者都 被满足时操作获得真值，这与"排他性或"操作相反，"排他性或"需要仅仅一个条件被满足。 词语"包括"用于指"包含"而不是意思是"由……组成"。上面认可的所有现有教导通过引 用并入本文。在本文之前公开的任何现有技术文件的认识不应解释为承认或表示在这些现 有技术文件公开时其教导是当时在澳大利亚或其他地方的公知常识。这里一起提交的序列 表的内容构成本发明说明书的一部分。
【主权项】
1. 一种基因修饰酵母细胞，其包含生产3-HP的活性发酵通路，其中所述细胞包含并 表达编码用于产生酶的外源性基因，所述酶与SEQ ID NO :1具有至少80%同一性并催化 0-丙氨酸和丙酮酸之间的氨基转移反应以产生丙二酸半醛。2. 根据权利要求1所述的基因修饰酵母细胞，其中所述酶是来自蜡状芽孢杆菌 (Bacillus cereus)AH1272 的转氨酶 YhxA。3. 根据权利要求1或权利要求2所述的基因修饰酵母细胞，其表达3-羟基异丁酸脱氢 酶即 HIBADH。4. 根据权利要求3所述的基因修饰酵母细胞，其中所述HIBADH来自铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌（P.putida)、赌状芽抱杆菌（Bacillus cereus) 或白色念珠菌（Candida albicans)。5. 根据前述权利要求中任一项所述的基因修饰酵母细胞，其表达3-羟基丙酸脱氢酶 即 3-HPDH。6. 根据权利要求5所述的基因修饰酵母细胞，其中所述3-HPDH来自勤奋生金球 菌（Metallosphaera sedula)、头寇倍硫化叶菌（Sulfolobus tokadaii)或大肠杆菌 (E. coli) 〇7. 根据前述权利要求中任一项所述的基因修饰酵母细胞，其表达产生天冬氨酸-1-脱 羧酶即EC 4. I. I. 11的外源性基因，和/或表达产生谷氨酸脱羧酶即EC 4. I. 1. 15的外源 性基因。8. 根据权利要求7所述的基因修饰酵母细胞，其表达来自谷氨酸棒杆菌 (Corynebacterium glutamicum)的天冬氨酸-1-脱羧酶（SEQ ID N052)或具有天冬氨 酸-1-脱羧酶活性且与SEQ ID N052至少80%同源的酶。9. 根据权利要求7所述的基因修饰酵母细胞，其表达来自赤拟谷盗（Tribolium castaneum)的天冬氨酸-1-脱羧酶（SEQ ID N068)或具有天冬氨酸-1-脱羧酶活性且与 SEQ ID N068至少80%同源的酶。10. 根据权利要求7所述的基因修饰酵母细胞，其具有增加的丙酮酸羧化酶和/或天冬 氨酸转氨酶活性。11. 根据权利要求10所述的基因修饰酵母细胞，其过表达天然丙酮酸羧化酶PYCl或 PYC2和/或天然天冬氨酸转氨酶AAT2。12. 根据前述权利要求中任一项所述的基因修饰酵母细胞，其中酵母是酿酒酵母 (S. cerevisiae) 〇13. -种生产3HP的方法，其包括培养前述权利要求中任一项所述的酵母细胞，和从培 养物回收3HP。14. 根据权利要求13所述的方法，其包括为培养物供应0 -丙氨酸和/或L-天冬氨 酸。15. 根据权利要求13或权利要求14所述的方法，其中每升培养基生产至少IOOmg 3HP 或从每升所述培养基回收至少IOOmg 3HP。
【专利摘要】一种基因修饰酿酒酵母，其包含生产3-HP的活性发酵通路，该基因修饰酿酒酵母表达外源性基因，所述外源性基因表达来自蜡状芽孢杆菌AH1272的、催化β-丙氨酸和丙酮酸之间的氨基转移反应以产生丙二酸半醛的转氨酶YhxA。所述酵母也可表达3-羟基异丁酸脱氢酶(HIBADH)、3-羟基丙酸脱氢酶(3-HPDH)和天冬氨酸1-脱羧酶。另外，酵母还可表达丙酮酸羧化酶和天冬氨酸转氨酶。
【IPC分类】C12N15/52, C12P7/52
【公开号】CN104884621
【申请号】CN201380062761
【发明人】伊里娜·博罗迪娜, 干乍那·吕克索姆他温·希尔德加德, 约亨·弗尔斯特, 弗雷德里克·奥贝格
【申请人】丹麦理工大学
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2013年10月10日
【公告号】CA2888093A1, EP2906701A1, US20150267228, WO2014057036A1