子 克隆实验指南》），ScFv基因和pCANTAB5E载体分别经Sfi I和Not I双酶切后，将ScFv基 因插入PCANTAB5E载体，构建重组表达质粒（参见图1)，并将其电转化TGl感受态细胞，转 化50次，合并所有电转化培养液，取一小部分系列稀释后涂布于YT-AG固体培养板，30°C过 夜培养计算库容量（挑取克隆进行菌落PCR和质粒双酶切验证，测序验证库的多样性）；通 过菌落PCR计算阳性率，得到实际的库容量。将剩余的细菌培养液通过辅助噬菌体M13K07 拯救后建立初级文库。
[0038] 实施例2牛源抗金黄色葡萄球菌单链抗体的筛选
[0039] 1 :富集淘选制备金黄色葡萄球菌全菌抗原（ATCC25923)，4°C包被过夜；用含4% 脱脂奶粉的PBS封闭96孔板37°C孵育2h ;向96孔板中加入上述步骤中制备好的单链抗 体噬菌体抗体库，37°C孵育2h，用PBST和PBS各洗10次，洗掉未结合的游离噬菌体；每孔 加入100 μ 1 0· 2mol/L Gly-Hcl缓冲液（pH = 2. 2)洗脱特异性结合的噬菌体，加入50 μ 1 lmol/L Tris-Hcl (PH = 9. 1)中和洗脱液；将剩余部分洗脱液感染大肠杆菌TGl后，重复上 述步骤。如此重复3-5轮，在第一轮过后，要增加洗涤的严谨性：洗脱前用PBST洗脱20次 后用PBS洗涤20次。
[0040] 2 :phage ELISA筛选从第四轮中随机取96个克隆，用M13K07拯救后制备重组噬 菌体。金黄色葡萄球菌全菌抗原（ATCC25923)用50mmol/L碳酸氢钠盐溶液（pH9. 6)于4°C 包被过夜，4%脱脂奶粉溶液封闭Ih后用PBST(0. 1% Tween20,以下同）洗涤3次；加入上 述制备好的噬菌体单链抗体，37°C反应2h，PBST和PBS各洗涤6次；加入HRP-antiM13抗体 100 μ L (1:4000)，37°C反应lh，PBST和PBS各洗涤6次；TMB显色，2mol/L硫酸终止反应，酶 标仪读取0D450值，同时设辅助噬菌体M13K07为阴性对照。ELISA结果的判定以P/N(P为 阳性孔的0D450值，N为阴性孔的0D450值）表示，P/N彡2. 1为阳性；1. 5彡P/N < 2. 1为 可疑；P/N < 1. 5为阴性（图2)。（参照姚火春主编《兽医微生物学实验指导》）。
[0041] 实施例3重组scFv序列分析
[0042] 对获得的 8 个单链抗体 ZW. 1，ZW. 2, ZW. 12, ZW. 22, ZW. 33, ZW. 68, ZW. 73, ZW. 88 编码 基因进行测序，证明其按照正确的阅读框顺序插入到噬菌粒载体PCANTAB5E中，所述氨基 酸序列如SEQ ID No. 17~24所示，其序列顺序是VL-Linker-VH。
[0043] 实施例4重组scFv序列表达产物纯化
[0044] 将获得的 8 个单链抗体 ZW. 1，ZW. 2, ZW. 12, ZW. 22, ZW. 33, ZW. 68, ZW. 73, ZW. 88 和 pET-28a载体经过NcoI和NotI双酶切后连接转化大肠杆菌Rosetta，经IPTG诱导表达并 进行纯化。
[0045] 实施例5scFv体外抑菌实验
[0046] 将获得的 8 个单链抗体 ZW. 1，ZW. 2, ZW. 12, ZW. 22, ZW. 33, ZW. 68, ZW. 73, ZW. 88 按照 一定的浓度配比混合后与106cfu/mL的金黄色葡萄球菌在LB培养基内共同孵育，生理盐水 和青霉素分别作为阴性对照和阳性对照组，每6h测一次0D600直至阴性对照组菌液浓度不 再变化。结果显示24h后，单链抗体联合处理组与青霉素处理组菌液一直透亮，0D600值约 为0. 06 ;而生理盐水处理组菌液浑浊度明显增加，0D600值约为1. 08 (图3)。
[0047] 实施例6金黄色葡萄球菌小鼠乳腺炎模型保护实验
[0048] 泌乳10-15d昆明小鼠随机分为4组，对照组，阴性对照，阳性对照组和抗体处 理组。对照组和阴性对照组第四对乳腺各攻入150 μ L生理盐水，阳性对照组第四对乳腺 各攻入100 μ L青霉素（lOOmg/mL)，抗体处理组第四对乳腺各攻入150 μ L单链抗体混合液 (I. lmg/mL)，6h后，对照组第四对乳腺各攻入生理盐水50 μ L，阴性对照，阳性对照组和抗 体处理组第四对乳腺各攻入108cfu/mL的金黄色葡萄球菌50 μ L，48h后，处死小鼠，采集血 液检测相关细胞因子，以评估保护效果。
[0049] 在金黄色葡萄球菌小鼠乳腺炎模型保护试验中，与生理盐水处理的阴性对照组相 比，8个单链抗体（scFv)能显著提高细胞因子IL-4的含量（P〈0. 05)(图4)，降低炎症因子 TNF- α的含量（P〈〇. 05)(图5)，维持乳腺结构的相对完整，减少炎性细胞的浸润，对小鼠提 供一定的保护作用。该单链抗体（scFv)具有良好的应用前景，能在制备金黄色葡萄球菌奶 牛乳腺炎预防和治疗药物中应用。
【主权项】
1. 一种牛源性抗金黄色葡萄球菌基因工程单链抗体，其特征在于，所述单链抗体 包括牛抗体轻链可变区VL、中间连接肽Linker和牛抗体重链可变区VH，其连接顺序是 VL-Linker-VH;其中： 所述牛抗体轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQIDNo:1~8所示； 所述牛抗体重链可变区VH的氨基酸序列如SEQIDNO:9~16所示。2. 根据权利要求1所述的牛源性抗金黄色葡萄球菌基因工程单链抗体，其特征在于， 所述中间连接肽的氨基酸序列如下： GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGATCCGGTGGCGGCGGATCTo3. 根据权利要求1所述的牛源性抗金黄色葡萄球菌基因工程单链抗体，其特征在于， 所述单链抗体的氨基酸序列如SEQIDNo: 17~24所示。4. 一种含有编码牛源性抗金黄色葡萄球菌基因工程单链抗体基因的载体，其特征在 于，该载体为噬菌粒载体。5. 根据权利要求4所述的含有编码牛源性抗金黄色葡萄球菌基因工程单链抗体基因 的载体，其特征在于，该载体为PCANTAB5E载体。6. -种由权利要求4或5所述载体转化的宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞为TGl细 胞。7. -种牛源性抗金黄色葡萄球菌基因工程单链抗体的制备方法，其特征在于，包括以 下步骤： (1) 采用RT-PCR直接从患奶牛乳腺炎的外周血单个核细胞RNA中扩增出抗体编码基因 的轻链可变区VL基因和重链可变区基因VH; (2) 利用SOE-PCR法将中间连接肽linker与VL基因和VH基因相连构建牛源性单链抗 体基因； (3) 将步骤（2)的牛源性单链抗体基因克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中，构建重组质 粒； (4) 将步骤（3)的重组质粒转化入大肠杆菌，培养并用辅助噬菌体M13K07扩增建立初 级单链抗体文库； (5) 用金黄色葡萄球菌全菌作为包被抗原，富集淘选四轮； (6) 采用phageELISA,用金黄色葡萄球菌全菌作为包被抗原，筛选阳性克隆； (7) 分离纯化步骤（6)所得培养产物，即获得所述牛源性抗金黄色葡萄球菌的单链抗 体。8. 权利要求1-3之一所述的牛源性抗金黄色葡萄球菌基因工程单链抗体在制备金黄 色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺炎预防和治疗药物中的应用。
【专利摘要】本发明属于基因工程技术领域，具体为一种牛源性抗金黄色葡萄球菌基因工程单链抗体、制备方法及其用途。所述的单链抗体所述单链抗体包括牛抗体轻链可变区VL、中间连接肽Linker和牛抗体重链可变区VH，其连接顺序是VL-Linker-VH；其中：所述牛抗体轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID No：1～8所示；所述牛抗体重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：9～16所示。本发明将筛选到的阳性克隆的单链抗体(scFv)联合应用进行体内外抑制金黄色葡萄球菌试验，取得了理想的抑菌效果，本发明单链抗体可用于制备预防和治疗金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎药物。
【IPC分类】C12N1/21, C12N15/70, A61K39/40, A61P31/04, C07K16/12
【公开号】CN104926941
【申请号】CN201510362092
【发明人】朱建国, 王曼, 张艳
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年6月26日