浓度为5. 0 X 103C〇pieS/ml的阳性参考品扩增曲线，CK代表阴性质控 品； 图6是沙眼衣原体定量检测试剂盒的检测限实验数据图，图中横坐标cycle表示扩增 循环数，纵坐标Λ Rn表示荧光强度，S6为25份浓度为5. 0 X 103C〇pieS/ml的阳性参考品扩 增曲线，CK表示阴性质控品。
【具体实施方式】
[0017] 本试剂盒采用Taqman探针法荧光定量PCR检测技术，快速检测临床样品中沙眼衣 原体特有序列，从而判断沙眼衣原体的存在。我们针对不同保守序列设计多对引物和探针， 并对其进行实验验证，最后选择了灵敏度高、特异性好的一对引物和探针。下面实施例中未 说明的常规方法和条件可参考《分子克隆实验指南》第三版或按照试剂制造商说明书中所 建议的步骤和条件。
[0018] 实施例1试剂盒的制备 1、 试剂盒特异性引物的设计与合成 根据网上公布的CT序列（GenBank :CP006677. 1)，针对沙眼衣原体保守基因 trpB片段 利用生物学软件Primer Premier 5软件以及Oligo 7软件对沙眼衣原体PCR引物进行设 计，并且用软件Mega4和NCBI在线Blast进行序列比对，保证每对引物特异性和合理性。引 物委托宝生物工程(大连）有限公司合成，采用PAGE纯化，试剂盒特异性引物核苷酸序列如 下： 正向引物：5' -GCATGAGTCAGGACGAGTT-3'， 反向引物：5' -CGAAACTAAATGTGCGAGAGC-3'， 荧光探针：5' -FAM-TTAGCCACCGATGAAGACCCGTTAC-TAMRA-3'， 2、 CT质粒阳性质控品的设计与制备 在上述CT特异性引物扩增序列的外围序列，重新设计一对扩增引物，该引物扩增片段 能完全覆盖住设计的CT特异性引物扩增区域。该外围引物委托宝生物工程(大连）有限公 司合成，采用PAGE纯化，该外围引物核苷酸序列如下： 正向引物：5' -AGGTGGCTCCAACGCTAT-3'， 反向引物：5' -TCTGTTTCTGCGGATGATTT-3'， 采用该引物扩增的特异性核苷酸序列为：
[0019] 利用上述外围引物和CT临床阳性样本DNA裂解液进行PCR扩增，将得到的PCR产 物纯化后连接到质粒PCR2. 1载体上，然后转化到大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，通过蓝白 斑初筛后，再经过PCR鉴定为阳性的菌落，通过扩大培养后，提取阳性重组质粒，经双向DNA 测序鉴定后作为制备阳性质控品和阳性定量参比品的原料。
[0020] 质粒pCR2. 1载体通过商业途径获得，购自于Invitrogen公司；大肠杆菌DH5 α感 受态细胞通过商业途径获得，购自于TAKARA公司。
[0021] 3、质控品的制备 制备阳性质控品的原料通过测定浓度和纯度后采用TE缓冲液10倍梯度稀释，制备阳 性质控品与弱阳性质控品，阳性质控品采用浓度为5. OX 107C〇pieS/ml的重组质粒；弱阳性 质控品采用5. OX 103copies/ml的重组质粒；阴性质控品采用无菌去离子水制备。
[0022] 制备阳性定量参比品的原料通过测定浓度和纯度后采用TE缓冲液10倍梯度 稀释，制备阳性定量参比品，阳性定量参比品浓度分别为Pl :5.0X106C〇pieS/ml，P2 : 5. OX 105copies/ml, P3 ：5. OX 104copies/ml, P4 ：5. OX 103copies/ml〇
[0023] 4、PCR反应液的制备 引物和探针的配置：将新合成的引物干粉离心I分钟，加入适量无菌去离子水(根据合 成量计算)，将引物溶解成100 μ M的母液，使用时再将100 μ M的母液稀释成10 μ M母液。探 针标记有荧光基团，因此需要避光保存。
[0024] PCR反应液的组成：20 μ 1的体系参考表1各组分的比例进行配置。
[0025] 5、DNA聚合酶液的配制 将购买的热启动Taq DNA聚合酶（2. 5U/yl)和UDG酶（5U/yl)按照10:1~20:1 (体 积比）混匀，做好标记，_20°C及以下冰箱中保存。
[0026] 实施例2试剂盒的使用方法 1、 样本要求 a. 样本采集：高压灭菌的特制拭子，伸入男性尿道口或女性宫颈口上1-2 cm，旋转一 周，停留约10秒后取出，将棉拭子头放入盛有I ml无菌生理盐水的样本冷冻保存管中，从 颈部剪断拭子，使拭子头浸入盐水中，反复漂洗，得标本漂洗液， b. 存放：标本漂洗液应在_20°C以下保存，三个月内无法检测的样本应于_70°C以下保 存；标本应设专柜或专库单独保存， c. 运输：采用冰壶加冰袋或泡沫箱加冰袋密封进行运输， 2、 样本制备即样本处理区 取500 μ 1标本漂洗液，10, 000 rpm离心2分钟，用移液器吸弃上清，保留沉淀；在 上述离心沉淀中加入50 μ I DNA裂解液(使用前确保将每49 μ I DNA裂解液中加入 ΙμL蛋白酶Κ)，振荡器上振荡10秒后，于95 °C沸水浴10分钟，10,000 rpm离心1分 钟取上清2ul用于检测；如果样本裂解产物当天不使用，建议保存在-20°C以下。
[0027] 3、样本检测 先在PCR准备区将PCR反应液置室温解冻混匀后，根据反应样品管数η (样品数= 标本数+ 3)吸取η X 17. 8 μ I PCR反应液，η Χ0. 2 μ I DNA聚合酶液，加入到一个离心管并 震荡混匀，瞬时离心后，分装于η个PCR反应管,每管18 μ 1,盖上管盖后转移到加样区,然后 在样本处理区依次向各PCR反应管中加入2 μ 1样品，样品包括样本、阳性质控品、弱阳性 质控品、阳性定量参比品与阴性质控品，使总体系达到20 μ 1，盖严管盖，混匀，低速离心数 秒；转移反应管至检测区，将反应管按样本、阳性质控品、弱阳性质控品、阳性定量参比品与 阴性质控品的次序，依次置于荧光PCR检测仪（ΑΒΙ St印One Plus)上，立即进行PCR扩增 反应。
[0028] 4、按照表2进行荧光PCR仪的程序设置 5、参考值(参考范围）
一般以仪器默认值为准，当出现少数样本扩增曲线的噪音太大等特殊情况时可适当调 整。ABI 7300或ABI St印One (Plus)基线设定：取3-15个循环的荧光信号。阈值设定： 使阈值线超过正常阴性质控品的扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，且CT值为Undet。
[0029] 6、质控标准 a) 阴性质控品：CT值=40或显示为"Undet"，判断为阴性， b) 阳性质控品：16< CT值<25,且有良好的扩增曲线，判断为阳性。定量参考值在 5X 106copies/ml ~5X 107copies/ml, c) 弱阳性质控品：30 < CT值<37,且有良好的扩增曲线，判断为阳性。定量参考值在 5 X 102copies/ml~ 5 X 103copies/ml 〇
[0030] 同时符合以上三个条件，判断实验为"有效"。
[0031] 7、结果判断 (1) 样品的CT=40或显示为"Undet"，判断为阴性，或判读为样品中的CT含量小于检测 限的量； (2) 样本检测结果：样本有良好的扩增曲线，5. OX 103copies/ml彡DNA载量 彡5. OX 10sC〇pieS/ml时，按实际检测量报告，或CT彡37,判读为阳性； (3) 样本检测结果：样本有良好的扩增曲线，DNA载量> 5.0X10sC〇pieS/ml，拷贝数仅 供参考，报告> 5. OX 10s copies/ml或判读为阳性； (4) 样本检测结果：样本有良好的扩增曲线，DNA载量< 5. 0X103copies/ml时，建议 重新检测，如果得到的结果依然为DNA载量< 5. 0 X 103C〇pieS/ml时拷贝数仅供参考，报告 <5.0X103copies/ml;37彡CT值<40时，建议重新检测，若CT值彡37,判断为阳性，否 则为阴性。
[0032] 实施例2试剂盒的性能评定 I、线性实