者延迟 或改善疾病进程。
[0152] 在第一方面，本发明提供了一种免疫抑制性寡核苷酸（INH0DN)化合物。术语"INH 0DN"指为针对一种或更多种TLR之拮抗剂的免疫调节性寡核苷酸化合物，其中所述化合物 包含寡核苷酸基序CC-Li-GGG和至少两个修饰，其中如果所述化合物包含少于4个连续的 未经修饰鸟苷核苷酸，则所述寡核苷酸基序将不具有免疫刺激性（例如，即使其包含未甲 基化的CpG)。这样的修饰可在寡核苷酸的5'端、在位于寡核苷酸基序侧翼的序列中和/或 在寡核苷酸基序内。这些修饰产生抑制TLR调节的免疫刺激的IR0化合物。这样的修饰可 针对碱基、糖残基和/或位于寡核苷酸基序侧翼或在寡核苷酸基序内的核苷酸/核苷的磷 酸骨架。
[0153] 尽管本发明涵盖具有对CG二核苷酸进行修饰的寡核苷酸序列，但是这样的序列 对TLR9无免疫刺激作用。与W0 2011/005942中公开的化合物相反，本发明的分子抑制TRL9 调节的免疫刺激。本文中公开的化合物是免疫抑制性寡核苷酸（INH0DN)。
[0154] 在一些优选实施方案中，所述INH0DN化合物不是反义寡核苷酸。本发明的一些 重要方面示于实施例和附图中。 实施例
[0155] 在三轮筛选中，已鉴定出具有经修饰核苷酸类似物的新型TLR拮抗剂，与US 2005/0239733 中所述之如具有序列 5'dT*dC*dC*dT*dG*dG*dC*dG*dG*dG*dG*dA*dA*dG*dT的SEQIDNO:4的原型TLR拮抗剂相比，这些新型TLR拮抗剂表现出强烈增强 的抑制活性。
[0156] 在体外测试中测试本申请中所公开的寡核苷酸的生物学活性，如下进行所述体外 测试：
[0157] 表达人TLR9或鼠TLR9或人TLR7以及6xNF-kB-萤光素酶报道基因构建体的稳 定转染的J1EK293细胞及其用途在文献（Bauer等（2001)PNAS98(16)，9237-42)，Heil等 (2004)Science303 (5663)，1529-9,Jurk等（2006)EurJ.Immunol. 36 (7)，1815-26)中进 行了广泛描述。
[0158] 将稳定转染子（2. 5xl04细胞/孔）铺板过夜并先与逐渐增加量的抑制性0DN在湿 润孵育箱（5%C02)中在37°C下孵育16h，随后添加各种激动剂：针对人TLR9,0. 5yM0DN 10103(Luganini等（2008)Antimicrob.AgentsChemother. 52,1111-1120 中公开的序列）； 针对鼠TLR9,0.5yMODN1826(如Bauer等（2001)PNAS98(16)，9237-42 中所述）；和针 对人TLR7,2yMR848(如Jurk等（2006)Eur.J.Immunol36(7)，1815-26 中公开的）。每个 数据点以一式两份方式进行。将细胞用〇neGlo?，Promega，Madison，WI，USA裂解并在于室 温下孵育10分钟后分析萤光素酶基因活性。
[0159] 通过参照未添加0DN的培养基中的报道基因活性来计算刺激指数。将单独TLR激 动剂的活性设定为100%并由此计算在存在抑制性0DN的情况下的抑制活性。
[0160] 实施例1
[0161] 在具有两个至三个化学修饰的0DN中获得抑制活性的最大增加。在第一轮筛选 中，dG被7-脱氮-dG(*dE* )、7_脱氮-2' -0-甲基-G(mE* )、肌苷（I* )、二氨基嘌呤（V ，、8_氧代-dG(0+ )和多种其它核苷酸类似物取代。合成并测试的0DN示于图1A至图1E 中。
[0162] 所述0DN主要在dC*dC*和dG*dG*dG*dG*之间包含单取代，其中所述取代还可 位于dG*dG*dG*dG* 内。
[0163] 具有一个突变（*dG*dG*dG*dG*中不同位置上的一个dG*被dE*替换）的0DN 之已按照上文所述测量的生物学活性示于图2和图3中。由图3可知，当GGG基序中的第 一个G被经修饰核苷酸取代时获得最佳生物学活性。图2和图3示出了E和mE取代的活 性。
[0164] 图4示出当dG+被无碱基残基D替换时，则抑制活性强烈下降。
[0165] 图5示出了当dT核苷酸被5-碘脱氧尿苷（JU)取代时的效果。意外地，（0DN 23655) 3'端的dT核苷酸被5-碘脱氧尿苷替换使衍生物的抑制活性增强。
[0166] 第一轮筛选步骤的结果总结于图6中。此图6中示出了经修饰碱基。在左栏中对 所使用的经修饰核苷酸进行了更详细的描述。
[0167] 实施例2
[0168] 已使用上述方法进行了第二轮筛选。寡核苷酸具有两个取代并且序列提供于图7 中。
[0169] 第二轮筛选的结果总结于图8中。已发现，5-甲基-C(dZ)与7-脱氮dG(dE)或与 2'-OMe-G(mE)组合的取代提高了抑制活性的效力。这可通过寡核苷酸25077观察到。此 外，序列中5'dT的缺失提高了抑制活性的效力（25077与25064的对比）。
[0170] 图9显示7-脱氮肌苷取代使抑制效力提高（特别参见25080)。
[0171] 图10示出了 5-甲基-dC(dZ)与7-脱氮-dG(dE)的组合在无5'dT的情况下的作 用。具有名称25069的化合物产生了最有效的抑制性0DN。
[0172] 图11示出了短0DN的抑制作用。5-Me-C和脱氮-dG/dl使对TLR9的效力提高。 脱氮-dG/dl的插入导致0DN对TLR9的效力提高。短的抑制性0DN仅抑制TLR9,而不抑制 TLR7。当与DI取代组合时，化合物25088中所示的5'延伸也使效力提高。
[0173] 由实施例2的结论，相关区域中的修饰的作用可总结如下：
[0174] ?包含紧邻G延展段5'的5-甲基-C的所有0DN都对hLTR9和mTLR9细胞系表现 出提尚的活性
[0175] ?G延展段中G1位置处的最有效碱基变换是：
[0176] .7_ 脱氮-dG(dE)
[0177] ? 7-脱氮-2 'OMe-G(mE)
[0178] ?脱氮-dl(DI)
[0179] ?5'dT的缺失使效力进一步提高。
[0180] 来自第二轮实验的最佳候选物总结于图12中。
[0181] 图13示出了意外的作用：紧邻GGG延展段3'的JU取代使抑制效力强烈提高。这 可从化合物106219的生物活性看出。
[0182] 图14示出了在JU取代位于序列中其他位置的情况下获得的意外结果。该结果不 在预期之内。
[0183] 实施例3
[0184] 已在第三轮筛选中对另一些突变进行了测试。寡核苷酸主要包含如图15中所示 的三元取代。
[0185] 如图16中所示，当组合三个替换时观察到抑制活性的意外增强，所述三个替换包 括G延展段3'的dA被5-碘-U替换。
[0186] 图17示出用5-溴dC替代5-medC被良好耐受。
[0187] 图18示出用5-辛二烯基-dC(ODC)替换5-medC在抑制活性方面被良好耐受。
[0188] 图19示出了当用5-甲基-LNA-C取代5-甲基-dC时的作用。
[0189] 图20示出了针对经5-溴-dC和5-甲基-dC修饰的类似物的数据。
[0190] 实施例4
[0191] 在如上文所述的测试中获得结果。为了确定INH-0DN的免疫刺激活性，不添加激 动剂（10103)。然而，在单独的小瓶中使用激动剂10103作为阳性对照。
[0192] 显示经修饰之强拮抗剂的未经修饰亲本0DN不刺激TLR9的数据总结于图21A、图 21B和图21C中。
[0193]
[0194] 图21D显示未经修饰亲本ODN2088和ODN2114的TLR9抑制活性与ODN2088中 的CG二核苷酸基序无关，因为产生AG二核苷酸基序之C至A的替换对抑制活性无显著影 响。
[0195] 图21E显示0DN2114无TLR9免疫刺激活性。
[0196] 实施例5
[0197] B细胞或浆细胞样树突细胞（pDC)中的细胞因子分泌抑制测定
[0198] 将B细胞或pDC在10倍滴定量的INH-0DN(0. 001yM至10yM)的存在下用激动剂 CpG-ODN1826(TLR9)或咪喹莫特（TLR7)刺激。使用补充有10%FCS和50yM2-巯基乙 醇的RPMI或DMEM作为培养基。24小时至72小时后，使用标准方法（ELISA，多重珠阵列） 在96孔微量滴定板中测定培养物上清液中的细胞因子水平。
[0199] 实施例6
[0200] 体内抑制活性的测定（细胞因子/趋化因子分泌的抑制）
[0201] 用INH-0DN经皮下、肌内、粘膜、腹膜内或鼻内处理小鼠，并随后用刺激性0DN 1826(TLR9)、poly-IC(TLR3)或咪喹莫特（TLR7)皮下攻击。在用TLR激动剂攻击后3小时， 将小鼠处死并制备血清。通过标准方法（ELISA，多重珠阵列）测定细胞因子（如IL-12p40 或IP-10)水平。
[0202] 实施例7
[0203] 胶原蛋白抗体诱导的类风湿性关节炎模型和胶原蛋白诱导的类风湿性关节炎模 型（例如Makino等J.NipponMoedSch2012, 79,129-138所述）。
[0204] 对小鼠腹膜内注射抗小鼠II型胶原蛋白的抗体。3天后，小鼠腹膜内接受50yg LPS。每天或每隔一天，以0.lmg/kg至25mg/kg的剂量经皮下