、腹膜内或鼻内注射TLR诘抗 剂，持续5至7天。在处理后，将小鼠处死并评价关节肿胀。制备受影响关节的总RNA并通 过RT-PCR参照看家基因来测定炎性mRNA(如NLPR3、A頂2、IL-1 0、TNF-a)的水平。此外， 炎性细胞因子和趋化因子的血清水平可使用标准方法进行测定。用拮抗剂处理小鼠将使炎 性细胞因子和蛋白质的水平显著降低。
[0205]TLR拮抗剂在类似的模型中也起作用，其中在完全弗氏佐剂（CFA)的存在下，通过 用牛或鸡II型胶原蛋白（经尾注射，200yg)免疫小鼠来诱导类风湿性关节炎。用TLR拮 抗剂处理小鼠将使导致疾病发作之对TLR3/7和9诱导的细胞因子产生的抑制降低。
[0206] 实施例8
[0207] 使用如文献（Roller等JImmunol. 2012,189,4612-4620)中所述的咪喹莫特诱导 的银肩病。
[0208] 将小鼠剃毛并施加艾特乐乳膏剂（包含5 %咪喹莫特，70_75mg)，持续至少连续5 天。在第一天的处理之后，每日给予TLR诘抗剂（或每隔一天，以0.lmg/kg至25mg/kg的 剂量经皮下、腹膜内或鼻内给予）。每日对小鼠的皮肤红斑、起鳞和硬度进行评价。在另一 些实验中，将背部皮肤样品用H&E染色并进行组织学评价。
[0209]实施例9
[0210] 采用使用（NZBxNZW)F1小鼠的小鼠狼疮模型。
[0211] 在疾病发作时（4月龄）开始处理（NZBxNZW)F1小鼠，此时约25%的小鼠开始 表现出蛋白尿。每周两次经皮下注射INH-〇DN(剂量为0.lmg/kg至25mg/kg)来处理小鼠， 持续5个月。在5个月的处理后（9月龄），测量蛋白尿和自身抗体水平。1个月后，确定 抗-dsDNA抗体并用组织学评价肾的IgG沉积。INH-0DN处理使狼疮小鼠的抗-dsDNA抗体 和肾中的IgG沉积减少。在经INH-0DN处理的狼疮模型小鼠中，蛋白尿和肾小球性肾炎减 轻，从而使经INH-0DN处理的小鼠的存活增加。
[0212] 实施例10
[0213]MRL-Fas(lpr)小鼠狼疮模型
[0214] 用INH-0DN每周两次经皮下或腹膜内注射或经鼻内处理MRL-Fas(lpr)小鼠超过 10周，并在最后的剂量后约3天处死小鼠。每两周采血清样品并检查抗-dsDNA抗体、测试 品血清浓度。在研究结束时（第10周），将肾冷冻在0CT培养基中并通过免疫组织化学检 查肾切片的IgG沉积。每两周收集尿并测试蛋白质。INH-0DN处理使狼疮小鼠的抗-dsDNA 抗体和肾中的IgG沉积减少。
[0215] 实施例11
[0216] 通过INH-0DN延迟8. 3-N0D小鼠中糖尿病的发作进程
[0217] 以0? lmg至25mg/kg的剂量每周3次对8.3-N0D小鼠（3至4周龄）注射INH-0DN 或对照（PBS或非刺激性且非抑制性0DN)。跟踪观察小鼠6周以确定糖尿病的自发性发作 速率。与经PBS或非刺激性0DN注射的小鼠相比，经INH-0DN处理的雌性小鼠表现出延迟 的糖尿病发生。类似地，经氯奎处理（例如，每日l〇mg/kg，腹膜内）的小鼠也表现出延迟的 糖尿病发作。因此，内源性TLR7/TLR9活化导致8.3-N0D小鼠中的糖尿病发作。
【主权项】
1. 具有以下通式的抑制性寡核苷酸： X1 C C N1 N2 N3 X2 N4 N5 G G G N6 X3 N7 (I) 其中 C是胞苷或其衍生物，其中所述胞苷衍生物选自5-甲基胞苷，具有涉及胞嘧啶碱基、胞 苷核苷的糖或胞嘧啶碱基和胞苷核苷的糖两者的化学修饰的胞苷样核苷酸，2' -O-甲基胞 苷，5-溴胞苷，5-羟基胞苷，核糖胞苷和胞嘧啶-P -D-阿拉伯呋喃糖苷， G是鸟苷或其衍生物，其中所述鸟苷衍生物选自7-脱氮鸟苷，具有涉及鸟嘌呤碱基、鸟 苷核苷的糖或鸟嘌呤碱基和鸟苷核苷的糖两者的化学修饰的鸟苷样核苷酸， &和X 3是具有0至12个碱基的任意核苷酸序列并且每个核苷酸独立于任何其他的核 苷酸，X2是具有0至3个核苷酸的任意核苷酸序列， N1、队和N 3各自独立地是任意核苷酸， 乂和N 7是嘧啶或经修饰嘧啶， 乂是嘌呤或经修饰嘌呤， 队是经修饰嘧啶、A或经修饰嘌呤， 其中核苷酸N4、N5、队或N 7中的至少两个是经修饰嘌呤或经修饰嘧啶。2. 根据权利要求1所述的抑制性寡核苷酸，其具有以下通式： X1 C C N1 N2 N3 X2 N4 N5 G G G N6 X3 N7 (I) 其中 C是如权利要求1中所限定的胞苷或其衍生物， G是如权利要求1中所限定的鸟苷或其衍生物， &和X 3是具有0至6个碱基的任意核苷酸序列并且每个核苷酸独立于任何其他的核 苷酸，12是0或1个核苷酸， N1、队和N 3各自独立地是任意核苷酸， 乂和N 7是嘧啶或经修饰嘧啶， 乂是嘌呤或经修饰嘌呤， 队是经修饰嘧啶、A或经修饰嘌呤， 其中核苷酸N4、N5、N6S N 7中的至少两个是经修饰嘌呤或经修饰嘧啶，并且其中所述寡 核苷酸包含至多或少于20个核苷。3. 根据权利要求1或2所述的抑制性寡核苷酸，其具有以下通式： N1 C C T G G py pu G G G px A G py (II) 其中 C是如权利要求1中所限定的胞苷或其衍生物， G是如权利要求1中所限定的鸟苷或其衍生物， N1是任意核苷酸或无核苷酸， py是啼啶或经修饰啼啶核苷酸， Pu是嘌呤或经修饰嘌呤核苷酸， px是经修饰嘧啶、A或经修饰嘌呤， 其中核苷酸py、pu和px中的至少两个是选自以下的经修饰噪呤或经修饰啼啶：7-脱 氣-脱氧鸟昔、7_脱氣_2' -〇-甲基鸟昔、肌昔、二氛基噪吟、6_硫代-脱氧鸟昔、6_0_甲 基-脱氧鸟昔、7_脱氣-肌昔、7 _脱氣_7_鹏脱氧鸟昔、7_氛基块丙基脱氧鸟昔、2_氣-胞 嘧啶、5-甲基胞嘧啶。4. 根据权利要求3所述的抑制性寡核苷酸，其具有以下通式： N1 C C T G G py pu G G G (III) 其中C、G、Np py和pu具有如前述权利要求中任一项所限定的含义。5. 根据权利要求3所述的抑制性寡核苷酸，其中 Py是选自5-甲基-dC、5-溴-dC和5-辛二烯基-dC的5-取代胞苷， Pu是选自7_脱氣_dG、7_脱氣_2' -〇-甲基-G、肌昔和7_脱氣-肌昔的7_脱氣噪吟 衍生物，并且Px是dA或5-碘-dU。6. 根据权利要求1所述的抑制性寡核苷酸，特征在于其具有序列dC * dC * dT * dG ★ dG ★ dZ ★ mE ★ dG ★ dG ★ dG ★ dA ★ dA ★ dG ★ dT。7. 根据权利要求1所述的抑制性寡核苷酸，特征在于其具有序列dC * dC * dT * dG ★ dG * BC * dE * dG * dG * dG * JU * dA * dG * dT。8. 具有通式IV的抑制性寡核苷酸： X1 AA T G G py pu G G G px A G py (IV) 其中 Py是选自5-甲基-dC、5-溴-dC和5-辛二烯基-dC的5-取代胞苷， Pu是选自7_脱氣_dG、7_脱氣_2' -〇-甲基-G、肌昔和7_脱氣-肌昔的7_脱氣噪吟 衍生物，并且Px是dA或5-碘-dU， Px是dA、5-取代脱氧尿苷和5-碘-尿苷，并且X1是任意核苷酸或无核苷酸。9. 根据权利要求1至8中任一项所述的抑制性寡核苷酸，其用作效力强烈增强的TLR 拮抗剂。10. 根据权利要求1至9中任一项所述的抑制性寡核苷酸，其用于预防和/或治疗癌 症、自身免疫病、气道炎症、炎性病症、感染性疾病、皮肤病症、变态反应、哮喘或由病原体引 起的疾病。11. 药物组合物，其包含至少一种根据权利要求1至9中任一项所述的抑制性寡核苷 酸。12. 根据权利要求11所述的药物组合物，其还包含至少一种添加剂和/或载体。13. 根据权利要求11或12所述的药物组合物，其用于治疗癌症、自身免疫病、气道炎 症、炎性病症、感染性疾病、皮肤病症、变态反应、哮喘或由病原体引起的疾病。
【专利摘要】公开了具有通式(I)的抑制性寡核苷酸，其可用于药物组合物，其中：在式(I)中，C是胞苷或其衍生物，其中所述胞苷衍生物选自5-甲基胞苷，具有涉及胞嘧啶碱基、胞苷核苷的糖或胞嘧啶碱基和胞苷核苷的糖两者的化学修饰的胞苷样核苷酸，2’-O-甲基胞苷，5-溴胞苷，5-羟基胞苷，核糖胞苷和胞嘧啶-P-D-阿拉伯呋喃糖苷；G是鸟苷或其衍生物，其中所述鸟苷衍生物选自7-脱氮鸟苷，具有涉及鸟嘌呤碱基、鸟苷核苷的糖或鸟嘌呤碱基和鸟苷核苷的糖两者的化学修饰的鸟苷样核苷酸；X1和X3是具有0至12个碱基的任意核苷酸序列并且每个核苷酸独立于任何其他的核苷酸；X2是具有0至3个核苷酸的任意核苷酸序列；N2和N3各自独立地是任意核苷酸；N4和N7是嘧啶或经修饰嘧啶；N5是嘌呤或经修饰嘌呤；N6是经修饰嘧啶、A或经修饰嘌呤，其中核苷酸N4、N5、N6或N7中的至少两个是经修饰嘌呤或经修饰嘧啶。X1CCN1N2N3X2N4N5GGGN6X3N7？？？？？(I)。
【IPC分类】C07H21/00, A61P37/02, A61P29/00, C12N15/117, A61K31/7088
【公开号】CN105051194
【申请号】CN201480004675
【发明人】欧根·乌尔曼, 玛丽恩·朱克, 托马斯·莱曼
【申请人】萨勒普塔医疗公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2014年1月13日
【公告号】CA2897125A1, EP2754714A1, EP2943572A1, US20150344884, WO2014108529A1