然后置50°C恒温箱保温备用。
[0029] 所述步骤二中指示菌为大肠杆菌。
[0030] 为了避免残留的微量氮源对试验的影响，所述步骤一中K2HP04、MgS04?7H20、 CaCl2?2H20、葡萄糖、FeS04?7H20、NaM〇04?2H20均为分析纯，琼脂使用前需用蒸馏水洗。
[0031] 实施例3。
[0032] -种无氮固体培养基，每升无氮固体培养基由以下原料组成： K2HP04 1. 5g MgS04 ? 7H20 0. 3g CaCl2 ? 2H20 0. lg 葡萄糖 12g FeS04 ? 7H20 0.0 lg NaMo04 ? 2H20 0. 0051g 琼脂 16g 蒸馏水 余量。
[0033] -种利用无氮固体培养基鉴定自生固氮菌是否分泌氨的方法，它包括以下步骤： 步骤一：将配方量的K2HP04、MgS04?7H20、CaCl2?2H20、葡萄糖、FeS04?7H20、 NaM〇04?2H20、琼脂和蒸馏水混合后搅拌均匀得到无氮固体培养基； 步骤二：制备双层平板，将步骤一得到的无氮固体培养基在118-124°C灭菌25分钟，待 灭菌后的无氮固体培养基温度降至47°C时加入指示菌，每100毫升无氮固体培养基加1毫 升指示菌，将加入指示菌的无氮固体培养基立即混匀倒入无菌培养皿，控制无氮固体培养 基的厚度在2. 6毫米，待无氮固体培养基凝固后再倒入厚度为0. 6毫米的一层水琼脂，这样 制作的平板即为双层平板，下层为含菌的无氮固体培养基，上层为不含菌的水琼脂； 步骤三：将待检测的自生固氮菌点到步骤二制备的双层平板上，置30°C恒温箱培养2至5天； 步骤四：结果检查，检查双层平板下层的指示菌是否有生长，如果发现指示菌出现生 长，则待检测自生固氮菌能分泌氨。
[0034] 所述步骤二中水琼脂的制备方法为：1升蒸馏水加15克琼脂，121°C灭菌20分钟， 然后置50°C恒温箱保温备用。
[0035] 所述步骤二中指示菌为大肠杆菌。
[0036] 为了避免残留的微量氮源对试验的影响，所述步骤一中K2HP04、MgS04 ? 7H20、 CaCl2? 2H20、葡萄糖、FeS04 ? 7H20、NaM〇04?2H20均为分析纯，琼脂使用前需用蒸馏水洗。
[0037] 实施例4。
[0038] -种无氮固体培养基，每升无氮固体培养基由以下原料组成： K2HP04 2g MgS04 ? 7H20 0. 5g CaCl2? 2H20 0. 15g 葡萄糖 13g FeS04 ? 7H20 0. 02g NaMo04 ? 2H20 0.Olg 琼脂 20g 蒸馏水 余量。
[0039] -种利用无氮固体培养基鉴定自生固氮菌是否分泌氨的方法，它包括以下步骤： 步骤一：将配方量的 K2HP04、MgS04 ? 7H20、CaCl2 ? 2H20、葡萄糖、FeS04 ? 7H20、 NaM〇04?2H20、琼脂和蒸馏水混合后搅拌均匀得到无氮固体培养基； 步骤二：制备双层平板，将步骤一得到的无氮固体培养基在124°C灭菌25分钟，待灭菌 后的无氮固体培养基温度降至48°C时加入指示菌，每100毫升无氮固体培养基加1毫升指 示菌，将加入指示菌的无氮固体培养基立即混匀倒入无菌培养皿，控制无氮固体培养基的 厚度在2. 8毫米，待无氮固体培养基凝固后再倒入厚度为1毫米的一层水琼脂，这样制作的 平板即为双层平板，下层为含菌的无氮固体培养基，上层为不含菌的水琼脂； 步骤三：将待检测的自生固氮菌点到步骤二制备的双层平板上，置30°C恒温箱培养2至5天； 步骤四：结果检查，检查双层平板下层的指示菌是否有生长，如果发现指示菌出现生 长，则待检测自生固氮菌能分泌氨。
[0040] 所述步骤二中水琼脂的制备方法为：1升蒸馏水加15克琼脂，121°C灭菌20分钟， 然后置50°C恒温箱保温备用。
[0041] 所述步骤二中指示菌为大肠杆菌。
[0042] 为了避免残留的微量氮源对试验的影响，所述步骤一中K2HP04、MgS04 ? 7H20、 CaCl2 ?2H20、葡萄糖、FeS04 ? 7H20、NaM〇04 ? 2H20均为分析纯，琼脂使用前需用蒸馏水洗。 [0043] 实验数据 本发明按照实施例1-4的方法，对200株不同的自生固氮菌进行测试，发现72株自生 固氮菌不同程度的能使指示菌生长，指示菌生长可参考图1，实验还发现这72株自生固氮 菌均能不同程度的促进植物生长，这说明这72株自生固氮菌均有不同程度分泌氨到细胞 外的能力。接下来又对这72株自生固氮菌进行固氮酶活性测试，结果发现68株均有不同 程度的固氮酶活性，而且固氮活性与指示菌直径具有相关性，指示菌直径越大，固氮酶活性 越高，分泌氨到细胞外的能力越强，详见表1。
[0044]表 1
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱 离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种无氮固体培养基，其特征在于：每升无氮固体培养基由以下原料组成： K2HPO4 0. 5-2g MgSO4 ? 7H20 0. 1-0. 5g CaCl2 ? 2H20 0. 05-0. 15g 葡萄糖 7-13g FeSO4 ? 7H20 0? 005-0. 02g NaMoO4 ? 2H20 0. 005-0.0 lg 琼脂 10_20g 蒸馏水 余量。2. 根据权利要求1所述的一种无氮固体培养基，其特征在于：每升无氮固体培养基由 以下原料组成： K2HPO4 0. 5-1 g MgSO4 ? 7H20 0. 1-0. 3g CaCl2 ? 2H20 0. 05-0.1 g 葡萄糖 7-10g FeSO4 ? 7H20 0? 01-0. 02g NaMoO4 ? 2H20 0.005-0.01 g 琼脂 l〇_15g 蒸馏水 余量。3. 根据权利要求1所述的一种无氮固体培养基，其特征在于：每升无氮固体培养基由 以下原料组成： K2HPO4 Ig MgSO4 ? 7H20 0. 2g CaCl2 ? 2H20 0.1 g 葡萄糖 10 g FeSO4 ? 7H20 0.01 g NaMoO4 ? 2H20 0.008 g 琼脂 15g 蒸馏水 余量。4. 一种利用权利要求1-3任一项所述的无氮固体培养基鉴定自生固氮菌是否分泌氨 的方法，其特征在于：它包括以下步骤： 步骤一：将配方量的 K2HP04、MgSO4 ? 7H20、CaCl2 ? 2H20、葡萄糖、FeSO4 ? 7H20、 NaMoO4 ? 2H20、琼脂和蒸馏水混合后搅拌均匀得到无氮固体培养基； 步骤二：制备双层平板，将步骤一得到的无氮固体培养基在118-124°C灭菌15-25分 钟，待灭菌后的无氮固体培养基温度降至46-48°C时加入指示菌，每100毫升无氮固体培养 基加1毫升指示菌，将加入指示菌的无氮固体培养基立即混匀倒入无菌培养皿，控制无氮 固体培养基的厚度在2. 2-2. 8毫米，待无氮固体培养基凝固后再倒入厚度为0. 5至1毫米 的一层水琼脂，这样制作的平板即为双层平板，下层为含菌的无氮固体培养基，上层为不含 菌的水琼脂； 步骤三：将待检测的自生固氮菌点到步骤二制备的双层平板上，置30°C恒温箱培养2 至5天； 步骤四：结果检查，检查双层平板下层的指示菌是否有生长，如果发现指示菌出现生 长，则待检测自生固氮菌能分泌氨到细胞外。5. 根据权利要求4所述的一种利用无氮固体培养基鉴定自生固氮菌是否分泌氨的方 法，其特征在于：所述步骤二中水琼脂的制备方法为：1升蒸馏水加15克琼脂，121°C灭菌 20分钟，然后置50°C恒温箱保温备用。6. 根据权利要求4所述的一种利用无氮固体培养基鉴定自生固氮菌是否分泌氨的方 法，其特征在于：所述步骤二中指示菌为大肠杆菌。7. 根据权利要求4所述的一种利用无氮固体培养基鉴定自生固氮菌是否分泌氨的 方法，其特征在于：所述步骤一中K2HP0 4、MgSO4 ? 7H20、CaCl2 ? 2H20、葡萄糖、FeSO4 ? 7H20、 NaMoO4 ? 2H20均为分析纯，琼脂使用前需用蒸馏水洗。
【专利摘要】本发明涉及培养基及固氮技术领域，具体涉及一种无氮固体培养基及利用其鉴定自生固氮菌是否分泌氨的方法。每升无氮固体培养基由以下原料组成：K2HPO4？0.5-2g、MgSO4·7H2O？0.1-0.5g、CaCl2·2H2O？0.05-0.15g、葡萄糖7-13g、FeSO4·7H2O？0.005-0.02g、NaMoO4·2H2O、0.005-0.01g、琼脂10-20g、蒸馏水余量。本发明提供了一种无氮固体培养基及利用其鉴定自生固氮菌是否分泌氨的方法，该方法简单易行，可以准确鉴定固氮菌是否分泌含氮化合物到胞外，以及分泌能力大小，为生物肥料行业的发展起到重要作用。
【IPC分类】C12Q1/02
【公开号】CN105063166
【申请号】CN201510588767
【发明人】杨国平, 孙旭生, 王亚君, 张洪彬, 杨盼盼, 尹坤
【申请人】东莞市保得生物工程有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年9月16日