在培养4611后，获得388/1生物质，其中蛋白质含量（通过~6.25来评估）为 36. 2%〇
[0120]实例2:在限制葡萄糖供应的情况下伸用分批给料发酵讲行耐热件小球藻的牛产
[0121] 在这个实例中，完整培养基的供应（分批给料模式）是在初始供应的葡萄糖被耗 尽后开始。发酵的其他操作参数保持不变。
[0122] 葡萄糖是使用500g/L浓缩溶液连续供应。供应速率低于该株系的最大消耗速率， 使得培养基中的残余葡萄糖含量保持为零，即该株系的生长受葡萄糖利用率限制（葡萄糖 限制性条件）。
[0123] 这个速率随时间以指数方式增加。用于计算添加流速的公式的特征为因子y，其 对应于如果该株系耗尽所供应的全部葡萄糖，该株系可采用的生长速率：
[0124] S = So x exp ( U . t)
[0125] S =葡萄糖供应流速（以g/h计）
[0126] So =初始葡萄糖供应流速，根据在该批次结束时存在的生物质来确定。在本发明 条件下，其为12g/h。
[0127] y =流速加速因子。它应低于0. llh \这是该株系在不存在营养限制时的生长速 率。
[0128] t =分批给料操作的持续时间（以h计）。
[0129] 盐是连续供应的，如果可能的话，单独供应或与葡萄糖混合供应。但它们还能以若 干个部分依序供应。
[0130] 下表4给出针对100g葡萄糖的盐要求。
[0131] 表 4.
[0132]
[0133] 除了葡萄糖以外的元素的浓度经确定为相对于该株系的营养要求过量的。
[0134] 视需要添加Clerol FBA 3107消泡剂以避免过多起泡。
[0135] 结果：在分批给料橾作期间葡萄糖供应谏率的效应
[0136] 在不同葡萄糖供应速率下以分批给料模式实施测试。其特征为所应用的y。所获 得的生物质蛋白质含量是通过以N 6. 25表示的总氮来测量。
[0137]表5.
[0138]
[0139] 这些结果显示，葡萄糖限制使得可能增加蛋白质含量。
[0140] 实际上，观察到，即使使用0.09的高y，所获得的蛋白质含量也高于无限制下获 得的蛋白质含量，如实例1中所示（39. 3%对比36. 2% )。
[0141] 借助葡萄糖的更严格的代谢限制导致蛋白质含量的额外增加。
[0142] 在这些测试条件下，需要对该株系应用低于0. 06h1的y以获得高于50%的蛋白 质含量。
[0143] 应注意，这个条件与生产率的降低有密切联系：在测试3中，0.56g/L/h对比 1.35g/L/h〇
[0144] 实例3 :在限制葡萄糖供应的情况下伸用连续恒化器发酵讲行耐热件小球藻的牛 芒
[0145] 在这个实例中，使用一个2L赛多利斯拜尔特B(SartoriusBiostatB)发酵罐。
[0146] 如实例2中所述实施发酵，但体积大小为1/10:接种物的体积为60ml并且初始体 积为1. 35L。
[0147] 培养基的连续供应是根据与实例2相同的原则开始的，在这种情形下将盐与葡萄 糖在给料罐中混合。供应速率是根据与实例2中相同的指数公式通过应用0.06h1的y来 加速。
[0148] 恒化器
[0149] 在达到1. 6L体积（生物质浓度为约50g/L)时，开始连续恒化器型操作：
[0150] 1.以96ml/h流速用具有以下组成的含有100g/L葡萄糖的营养培养基溶液对发酵 罐进行连续给料：
[0151]表6.
[0152]
[0153] 除了葡萄糖以外的元素的浓度经确定为相对于该株系的营养要求过量的。
[0154] 2.借助连接到一个栗的一个虹吸管从发酵罐连续移除培养基，以将培养物体积维 持在1. 6L。
[0155] 因此，每小时更换该培养基的0. 06/1部分（6% )。这个更换速率被称为稀释率
[0156] 根据恒化器培养方法的原理，将该株系的生长速率（i〇确立为相同值，因为该株 系的生长受葡萄糖供应限制：
[0157] D=u=0. 06h1
[0158] MM.
[0159] 在以恒化器模式操作97h后，生物质浓度稳定在48g/L±2g/L并且蛋白质含量稳 定在 53% ±2%。
[0160] 由于限制葡萄糖以及强加的低生长速率（都同时确保约2. 9g/L/h的极佳生产 率），由于高生物质浓度，这种操作模式使得可能获得具有高蛋白质含量的生物质。
[0161]实例4:在限制或不限制磷酸盐供应的情况下伸用分批发酵讲行原壳小球藻的牛 芒
[0162] 所用株系是原壳小球藻（株系CCAP211/8D-英国苏格兰的藻类和原生动物培养 物保藏中心）。
[0163]预培养:
[0164] 〇在一个500ml埃伦迈尔烧瓶中的150ml培养基；
[0165] 〇该培养基的组成：40g/L葡萄糖+10g/L酵母提取物。
[0166] 在以下条件下继续孵育：持续时间：72h;温度：28°C;振荡速度：110rpm(伊孚森莫 特顿孵育器）。
[0167] 然后将预培养物转移到一个2L赛多利斯拜尔特B发酵罐中。
[0168]牛物质产牛培养:
[0169] 培养基的组成如下（以g/L计）：
[0170]表 7.
[0171]
[0172] 磷酸盐供应经计算为在测试1中是限制性的并且在测试2中是过量的。视需要添 加Clerol FBA 3107消泡剂以避免过多起泡。在接种后将发酵罐的初始体积（VJ调节到 lL〇
[0173] 发酵的操作参数如下：
[0174] 表 8.
[0175]
[0176]结果:
[0177] 表 9.
[0178]
[0179] ^这些结果显示，通过在发酵结束时不存在残余磷酸盐确认的对磷酸盐供应的限制 来限制生长速率（通过累积y测量），并且如同先前实例中的葡萄糖限制一般，导致蛋白质 含量增加达到显著大于50%的值。
【主权项】
1. 一种异养生长的微藻的蛋白质富集的方法，所述微藻是小球藻（Chlorella)属，该 方法特征在于该异养培养包含旨在借助发酵培养基中非氮营养源的缺乏来限制所述微藻 生长的步骤，由此使得生物质蛋白质含量可能达到大于50重量％。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于该缺乏的非氮营养源是选自由葡萄糖和磷 酸盐组成的组的营养物质。3. 根据权利要求1和2中任一项所述的方法，其特征在于该营养源是缺乏的，以使所获 得的生长速率比不限制所述营养源的生长速率低10%到60%。4. 根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其特征在于小球藻属的微藻选自由耐热 性小球藻（Chlorella sorokiniana)和原壳小球藻（Chlorella protothecoides)组成的 组。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于供应该营养物质以获得介于0. 06h 1与 0. 09h 1之间的生长速率。6. 根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其特征在于该缺乏性培养期的持续时间 为至少lh，优选地至少10h，更优选地至少20h，具体地介于30h与60h之间。7. 根据权利要求1到6中任一项所述的方法，其特征在于微藻物种耐热性小球藻的异 养培养包含： a. 其中使这些微藻生长的第一步骤，其中将葡萄糖供应速率调节到所述微藻的消耗能 力，以快速获得大量生物质， b. 其中这些微藻产生蛋白质的第二步骤，其中将葡萄糖供应速率设定为显著低于所述 微藻的葡萄糖消耗能力的值，以防止储存物质的额外积累或促进其消耗。8. 根据权利要求1到6中任一项所述的方法，其特征在于微藻物种原壳小球藻的异养 培养包含在磷酸盐缺乏下进行培养的步骤，该步骤限制生长速率并导致蛋白质含量增加。
【专利摘要】本发明涉及一种在异养条件下生长的微藻的蛋白质富集的方法，所述微藻是小球藻属，该方法特征在于该异养培养包含旨在借助发酵培养基中非氮营养源的缺乏来限制所述微藻生长的步骤。
【IPC分类】C12P21/00, C12N1/12
【公开号】CN105073976
【申请号】CN201480019199
【发明人】加布里埃·马卡尔, 西尔万·德拉罗什, 马里·勒吕耶, 劳伦特·塞盖拉
【申请人】罗盖特兄弟公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2014年3月27日
【公告号】WO2014154787A2, WO2014154787A3