C，200rpm震荡培养 90min(LB培养基一直放在火焰边上）；
[0075] 4.在无菌的超净工作台，LB培养基高压灭菌后稍微冷却至锥形瓶不烫手时，加入 预先配置的氨苄溶液，摇匀，趁热倒平板；吸取l〇〇yL转化的感受态细胞用三角刮刀均匀 涂布在平板上至平板上的菌液完全吸收；
[0076] 5.剩余菌液离心，弃800yL上清，余下混匀，取70yL另涂平板；
[0077] 6. 37°C下倒置平板培养12h。
[0078] 3)阳性克隆筛选
[0079] 用灭菌烘干的枪头挑取平板上生长的白色斑点至已配置好的50yL验证用PCR反 应体系中，进彳丁阳性克隆鉴定。测序引物为：
[0080] Ml3-47 :5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3，；
[0081] RV-M:5，-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3，；
[0082] 验证用PCR扩增的反应体系和反应条件见表4、表5。
[0083] 表4PCR扩增反应体系
[0087]用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，拍照成像，并保存分析。挑取插入正确片段 的阳性克隆子送铂尚测序公司测序。
[0088] (5)系统发育分析
[0089] 将测序结果用DNAman、BioEdit软件进行编辑分析，将相似性高于98%的序列归 为同一属的菌种，序列通过GenBank数据库中BLAST进行比对，取相似性最高的20条序列， 用MEGA5. 05分析序列并构建系统发育树。
[0090] 通过上述的鉴定方法，本发明获得菌种为一种属于盐单胞菌属的菌种，但是，与现 有的盐单胞菌属的菌种，有显著区别，其区别在于：来源地不同。本发明获得菌种来源于垃 圾填埋场的矿化垃圾，并且具有优异的苯酚降解能力。
[0091] 本发明的筛选方法，为一种高通量培养降解苯酚的嗜盐菌群的方法，将细菌耐盐 和降解能力作为筛选压力设计高通量筛选流程，能够从环境样品中进行快速筛选，在不同 盐度下具有最优降解能力的嗜盐菌群，大大减少了摇床占用体积及试剂需耗量，从而实现 了微型化筛菌，可以用于大规模快速筛选不同样品中的降解菌。
[0092] 本发明所述的菌种，具有降解苯酚的优异能力，可以作为生物处理高盐含酚废水 的菌种；
[0093] 将本发明的菌种，降解苯酚的微生物的方法，包括如下步骤：
[0094] (1)先对所述的菌种进行培养，培养方法如下：
[0095] 菌株按照5 %的接种量接种于含15mL的改进的MSM液体培养基（MgCl2:0. 5g/L， KH2PO4=O. 45g/L，K2HPO4=O. 9g/L，NH4Cl:0? 3g/L，KCl:0? 3g/L，酵母膏：5g/L，氯化钠分别为 3%，5%，8%，10%，12% (w/v))的试管中，每支试管装液量5mL，30 °C，150rpm培养至停滞 期；
[0096] 培养物全部转移到50mL离心管中，然后4000rpm，20°C离心15min收集菌体，用无 菌的等渗溶液（无机盐离子成分与所用培养基成分相同，不加有机物质，预先121°C高压灭 菌20min)洗涤菌体，然后相同条件离心收集菌体，重悬于IOmL等渗溶液中；
[0097] (2)转接上述菌液至50mLMSM，并添加500mg/L苯酸作为唯一碳源和能源物质的 培养基中，氯化钠浓度为3% -12% (w/v)，30°C，150rpm下处理68h，即可去除苯酚，去除率 达94%以上。
[0098] 本发明采用48孔深孔板培养菌液，基于4-氨基安替比林比色的96孔酶标仪板分 光光度法测定苯酚浓度，并首次应用该方法从被高盐及有机物污染的43个环境样品中筛 选高效降解苯酚的中度嗜盐菌，从最优菌群E3中分离并鉴定了一株中度嗜盐菌，并研究其 耐盐降解机制。研究结果为环境降解菌的快速筛选提供了方法学依据，同时也为处理高盐 含酚废水提供技术支持。
【附图说明】
[0099]图1为基于4-氨基安替比林比色的96孔酶标仪板分光光度法标准曲线。
[0100] 图2为不同嗜盐菌群对苯酚的降解率。
[0101] 图3为Halomonassp.PH4-5在不同盐度下对苯酸的降解曲线。
【具体实施方式】
[0102] 实施例1
[0103] 从8种被高盐及有机物污染的环境中采集了 43个环境样品（表6)。先按筛选方 法步骤（1)富集在125-mL血清瓶中，转接3次后获得无沉淀物的菌群。
[0104] 表6样品米集彳目息
[0106] 43个培养物（N〇:Al-HI)按筛选方法步骤⑵分别转接至48孔深孔板中，于 30°C，200rpm培养72h。按照筛选方法步骤（3)采用基于4-氨基安替比林比色的96孔酶 标仪板分光光度法测定深孔板内剩余苯酚浓度。将48孔深孔板中200yL菌液转移至96 孔酶标仪板中，整块96孔酶标仪板2500Xg离心20min，上清液转移至新的96孔酶标仪板 中，按一定比例稀释至300yL，加入3yL氨水缓冲液，加入4 -氨基安替比林6yL，混匀， 再加6yL铁氰化钾，充分混匀后放置lOmin，于510nm波长处用酶标仪读取每个微孔中吸 光度值。
[0107] 基于4-氨基安替比林比色的96孔酶标仪板分光光度法的标准曲线公式为y= 0. 08808x+0. 00203，R2= 0. 9988(见图1)，筛选结果显示（见图2)，图2中，横坐标为菌群， 其中，Al~A6,Bl是来自察尔汗盐湖的培养菌群；B2~B6,Cl，C2是来自新疆盐湖的培养 菌群；C3~C6,Dl，D2是来自大庆盐碱土的培养菌群；D3~D6,El~E6,Fl，F2是来自上 海老港垃圾填埋场的培养菌群；F3~F6,Gl~G3是来自东海海滨的培养菌群；G4~G6,Hl 是来自上海高桥石化厂的培养菌群。
[0108] 43个嗜盐菌群中10个菌群能够在3% -10%(WZV)NaCl下降解超过50%的苯酚 (初始苯酚浓度为500mg/L):编号依次为C3,C4,D6,E3,E4,E5,E6,Fl，G4和G5,它们来自 大庆盐碱土、上海老港填埋场及上海高桥石化厂（见表7)。
[0109] 表7筛菌结果
[0110]
[0111] 在这些嗜盐菌群中，E3降解效果最好，在3%，5%，8%，10%和12%NaCl(w/v)条 件下，初始500mg/L苯酚去除率分别为96. 0 %，99. 2 %，99. 1 %，95. 4 %和88. 5 %，E3来自 上海老港垃圾填埋场矿化垃圾，填埋时间1994年。然后，从最优菌群E3中通过反复分离划 线分离出5株单菌，比较不同单菌对苯酚的降解特性，得到Halomonassp.PH4-5菌株在宽 泛的盐度范围内具有最佳的苯酚降解能力。
[0112] 实施例2
[0113] Halomonassp.PH4-5接种至含500mg/L苯酚和3% -12% (w/v)氯化钠的MSM培 养基中，考察对苯酚的降解。
[0114] Halomonassp.PH4-5最佳生长和降解盐度为5%。该菌株在含500mg/L苯酸的 MSM培养基中生长68h后，在3%，5%，8%，10%，12%(￥八)似(：1时，苯酚去除率分别为 96.2% ,99.8% ,98.9% ,94. 7%和86.3% (见图3)。该菌株在3% - 10%盐度范围内对 500mg/L的苯酚去除率均达94%以上，能够在宽泛的盐度范围内降解高浓度的苯酚，体现 出中度嗜盐菌的优势，可用于高盐含酚废水的生物处理。
【主权项】
1. 降解苯酸的中度嗜盐菌（Halomonas sp. )PH4_5,保藏号为CGMCC10666。2. 根据权利要求1所述的降解苯酸的中度嗜盐菌（Halomonas sp. )PH4-5的筛选方法， 包括如下步骤： (1) 从被高盐及有机物污染的环境中，采集环境样品； 在血清瓶中，加入环境样品和培养基： 所述的培养基中含有： NaCl (100g/L), MgCl2 (0. 5g/L), KH2PO4 (0. 45g/L), K2HPO4 (0. 9g/L), NH4Cl (0. 3g/L), KCl (0. 3g/L)，苯酚（lOOmg/L)，酵母膏0. 2g/L和微量元素（lg/L)，pH为7. 0 ; 血清瓶置于30°C，150rpm的条件下暗处培养，瓶子顶部空气作为氧气来源，转接3-4次 后，获得无沉淀物的菌群； 转接：取5mL富集后的菌液转入新的血清瓶中，加入45mL新鲜的培养基，接种量为 10%〇 (2) 将 NaCl 浓度分别为 3% (w/v)、5% (w/v)、8% (w/v)、10% (w/v)、12% (w/v)和 15% (w/v)置于48孔深孔板的深孔中，每孔中，含有苯酚和MSM，苯酚浓度为SOOmglAMSM 浓度为ImL ; 准备6个48孔深孔板； 将步骤（1)的培养物转接至48孔深孔板中，于30°C，200rpm培养72h ; (3) 在上述相同培养条件下，转接三次后，采用基于4-氨基安替比林比色的96孔酶标 仪板分光光度法测定剩余苯酚浓度； 比较在不同盐度下的苯酚降解特性，即可获得所述的菌种。3. 根据权利要求1所述的降解苯酸的中度嗜盐菌（Halomonas sp.)PH4-5的应用，其特 征在于，用于生物处理高盐含酚废水。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，应用方法，包括如下步骤： (1)先对所述的菌种进行培养； ⑵转接上述菌液至50mL MSM，并添加500mg/L苯酸作为唯一碳源和能源物质的培养 基中，氯化钠浓度为3%~12% (w/v)，30°C，150rpm下处理68h，即可去除苯酸。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，培养方法如下： 菌株按照5%的接种量接种于含151^的改进的1^11液体培养基（1%(：12:0.58/1， KH2PO4=O. 45g/L，K2HPO4=O. 9g/L，NH4Cl :0? 3g/L，KCl :0? 3g/L，酵母膏：5g/L，氯化钠分别为 3%，5%，8%，10%，12% (w/v))的试管中，每支试管装液量5mL，30 °C，150rpm培养至停滞 期； 培养物全部转移到50mL离心管中，然后4000rpm，20°C离心15min收集菌体，用无菌 的等渗溶液（无机盐离子成分与所用培养基成分相同，不加有机物质，预先121°C高压灭菌 20min)洗涤菌体，然后相同条件离心收集菌体，重悬于IOmL等渗溶液中。
【专利摘要】本发明公开了一种降解苯酚的中度嗜盐菌及其高通量筛选方法和应用，所述的降解苯酚的中度嗜盐菌(Halomonas？sp.)PH4-5，保藏号为CGMCC10666。本发明采用48孔深孔板培养菌液，基于4-氨基安替比林比色的96孔酶标仪板分光光度法测定苯酚浓度，从被高盐及有机物污染的43个环境样品中筛选高效降解苯酚的中度嗜盐菌，从最优菌群E3中分离并鉴定了一株中度嗜盐菌，并研究其耐盐降解机制。研究结果为环境降解菌的快速筛选提供了方法学依据，同时也为处理高盐含酚废水提供技术支持。CGMCC No.1066620150326
【IPC分类】C12Q1/04, C12R1/01, C12N1/20, C02F3/34
【公开号】CN105087425
【申请号】CN201510316733
【发明人】李辉, 刘勇弟, 王晓丽, 陆志艳, 陶萍, 武骁
【申请人】华东理工大学
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年6月11日