利用ForteBio Data Analysis Software7.0对结果进行分析。
[0039] 实施例3 结果 1.中华绒螯蟹Esflol的原核表达 1. 1Esflol原核表达载体构建 本实验成功构建了PET30-Esfl〇l表达载体，并通过Rosetta菌株进行原核表达成功获 得了重组Esflol蛋白。在构建原核表达体系的过程中，表达菌株的选择至关重要。Esflol 分子量较大，属于膜蛋白，通过原核表达并得到具有一定难度。真核细胞密码子偏好性和原 核系统有所不同，因此，在利用原核系统表达真核基因的时候，真核基因中的一些密码子对 于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低。Esflol蛋白中就 具有这样的稀有密码子。所以最终选择Rosetta菌株作为表达菌株，Rosetta是一种携带 PRARE2质粒的BL21衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的七种稀有密码子对应的tRNA，提高外源 基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平，同时它又能够促进二硫键的形成，帮助表 达需要借助二硫键形成正确折叠构象的真核蛋白。Esflol蛋白的获得为下一步的研究提供 了实验材料，为对其功能的探索奠定了基础。图1中显示为构建好的PET30-Esflol原核表 达载体转化到Rosetta菌株后挑选单一克隆的PCRinsertcheckl%琼脂糖凝胶电泳结果。 在目的大小1300左右的位置出现清晰单一的条带，后经测序证明为接入了Esflol的PET30 载体，证明原核表达体系构建成功。图2稀有密码子分析显示Esflol中含有12个稀有密 码子，较适合选用Rosetta作为表达菌种。
[0040] 1. 2PET30_Esflol与PET30空载体诱导表达对照以及Esflol的纯化 由图三中重组载体与空载载体诱导表达的对照结果可以看出，虽然重组载体诱导表达 〇h与6h后并未观察到有某一蛋白呈现出表达量由少至多的变化，但是经过和空载PET30诱 导表达结果进行对比不难发现，在预测大小48kD的位置上，重组载体的0h、6h和包涵体沉 淀样品中均出现了空载表达时不存在的蛋白条带，后经镍柱His标签特异性纯化，条带更 加明显，确定了重组载体成功表达了Esflol蛋白。
[0041] 1. 3Esflol蛋白的复性冻干及质谱鉴定结果 纯化后的Esf1〇1蛋白，经过复性冻干，取部分粉末溶解于2%SDS中，经SDS-PAGE检测 后发现，在预测大小48kD的位置有一条单一清晰的蛋白条带。割取此条带进行蛋白质谱分 析，质谱测序结果得到的氨基酸序列与Esflol根据mRNA翻译预测的氨基酸序列进行对比， 有五条以上成功匹配，证明通过原核表达得到的蛋白确为Esflol蛋白。
[0042]与Esflol的Pull-down结果分析 Pull-down实验是利用一种蛋白与亲和柱特异性结合作为诱饵蛋白，从而筛选出能与 诱饵蛋白特异性结合的蛋白。本实验假定CHH与Esflol蛋白为上游激素与下游直接受体的 关系，所以选择原核表达获得的拥有6个组氨酸标签的rCHH作为诱饵蛋白，从中华绒螯蟹 肝胰腺组织中提取的包含有Esflol的膜蛋白样品作为待捕获蛋白。因为原核表达获得的 rCHH与rEsflol都具有His标签，为了避免待捕获蛋白与亲和柱的非特异性结合，应避免 待捕获蛋白自身带有His标签，而具有生理活性的CHH半衰期较短，只有10-15min，较不容 易从生物体中直接获得。所以最终确定原核表达获得经过复性的rCHH作为诱饵蛋白，含有 Esflol蛋白的中华绒螯蟹肝胰腺组织膜蛋白提取物作为待捕获蛋白样品进行Pull-down 实验。从实验结果显示，实验组中虽然并未见在Esflol蛋白目的大小位置出现对应条带， 但是在26kD-17kD之间出现了单一清晰明亮的两条带，两条条带分子量之和约为48kD。因 为Esflol蛋白的抗体与Esflol蛋白的相互识别是具有特异性的。之后仅用重组Esflol 进行Pull-down实验得到了同样结果。所以分析第一次实验结果中出现的两条条带可能是 Esflol蛋白与rCHH蛋白结合后造成了Esflol蛋白的降解，或是Pull-down体系使Esflol 蛋白降解，从而造成了WesternBlot结果最终呈现出两条小分子量的条带，后经对照实验 也验证了这一推测。图5、图6中显示在48kD左右的位置阳性对照有明显的条带，而在实验 组中，于26kD至17kD大小间出现两条清晰明亮的条带。
[0043] 大分子互作仪检测Esflol与CHH的结合结果分析 Fortebio生物大分子互作仪基于生物膜层反射光干涉技术，可以检测未标记的生物分 子之间的相互作用情况。本实验运用此技术，将rCHH作为作用底物，令四种浓度的rEsf1〇1 与之反应，观察结果最终发现分子结合动力学系数KD=1. 83x10-9,表明了rCHH可以与 rEsflol直接结合，验证了之前实验的推论，证明了Esflol是CHH的直接作用蛋白。图七 中显示将生物素化的rCHH作为作用底物，四种浓度的Esflol与之结合的情况。观察结果 最终发现分子结合动力学系数KD=1. 83x10-9,表明了CHH可以与Esflol直接结合，Esflol 能够作为CHH的受体参与CHH对河蟹血糖水平的调控。能够缩短养殖产业上中华绒螯蟹的 养殖周期，实现养殖户利润的最大化，同时可以提高养殖河蟹的平均重量，增加亩产，更可 以达到提升熟蟹肝胰腺的营养价值和风味的效果。
[0044] 讨论 机体的生理过程是被体内的诸多神经多肽调节的。在节肢动物中，很多的神经多肽是 通过G蛋白藕连信号通路，并且有环核苷酸的参与（cAMP和从cGMP)以及二价钙离子的参 与。当十足目办）的甲壳动物受到外界环境刺激的时候，MIH和CHH通过激活信号 通路增加cAMP和cGMP的含量来抑制蜕皮。之前的研究结果表明，蟹的Y器官细胞膜存在 一个特异的MIH和CHH受体。CHH的受体很可能是在膜上的鸟氨酸环化酶。但是，CHH对蜕 皮的抑制效果比MIH小10到20倍，这也明示着CHH的主要功能是调节葡萄糖代谢而不是 抑制蜕皮。先前的研究已经表明，CHH调节糖代谢的主要效应器官是肝胰腺和肌肉，但是该 多肽激素的受体一直没能确定下来。本研究中，为了理清CHH调节的糖代谢途径下游的效 应分子，我们做了转录组分析和表达特征分析。在去除眼柄之后表达量有明显变化的所有 单一基因中，由于其所在家族成员参与人的胰岛素信号通路，我们选择了Esflol这一基因 作为研究对象。此外，该基因的表达量在去除眼柄之后有了 2. 8倍的提高。以上结果都显 示出Esflol基因在河蟹肝胰腺中参与到了糖代谢的过程当中。
[0045] 本研究克隆到了Esflol基因的全长cDNA序列并将其与人的flotillinl基因进 行比对，发现N端存在一个SPFH结构域（stomatin/prohibitin/flotillin/HfIK/C)， 从第6个氨基酸残基到第188个氨基酸残基。SPH1结构域存在于多种真核以及原核生物的 膜蛋白中，如prohibitin(抗增殖蛋白），stomatin(红细胞7. 2b蛋白)和podocin(肾小球 足细胞特异表达的跨膜蛋白），这些蛋白都有很多不同的功能。但是，flotillin不用于SPH1 家族成员，它有一个特征性的输水跨膜区域。在我们的研究中，疏水性分析显示Esflol含 有一个输水结构域，揭示了该蛋白为一个跨膜蛋白。河蟹肝胰腺组织切片的免疫组化结果 进一步印证了这一推断。而且，基因序列分析显示Esflol蛋白含有两个可能的cAMP或cGMP 依赖性蛋白激酶磷酸化位点，提示Esflol存在参与到cAMP/cGMP介导的信号通路的可能 性。所有结果都证明Esflol是CHH调控的信号通路中的一环。
【主权项】
1. 一种对CHH具有结合活性的重组河蟹Esf Iol蛋白，其特征在于该蛋白具有426个氨 基酸，如SEQ ID NO. 1所示，编码的蛋白理论等电点为9. 150,分子量为47. 18kD;该蛋白具 有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，所对应的基因序列中开放阅读框（ORF)全长1281bp。2. 权利要求1所述对CHH具有结合活性的重组河蟹Esf Iol蛋白在和CHH特异结合，缩 短中华绒螯蟹的生长期，加快其生长发育方面的应用。3. 权利要求2所述的应用，其中缩短中华绒螯蟹的生长期指的是提高河蟹肝胰腺糖原 累积，提升熟蟹肝胰腺的营养价值和风味。4. 一种表达中华绒螯蟹Esflol的特异性引物，具有如下的核苷酸序列 Fl:5 <-AATTCCATATGATTCCCATTTTCATCA-3,； Rl:5 '-AATTCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCTACACGGAGGTT-3 '。
【专利摘要】本发明公开了一种对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白及应用，该蛋白具有426个氨基酸，如SEQ？ID？NO.1所示，编码的蛋白理论等电点为9.150，分子量为47.18kD；该蛋白具有SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列，所对应的基因序列中开放阅读框（ORF）全长1281bp。实验结果表明：河蟹肝胰腺组织切片的免疫组化结果进一步印证了这一推断。而且，基因序列分析显示Esflol蛋白含有两个可能的cAMP或cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点，提示Esflol存在参与到cAMP/cGMP介导的信号通路的可能性。结果证明Esflol是CHH调控的信号通路中的一环。对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白在和CHH特异结合，提升了熟蟹肝胰腺的营养价值和风味。
【IPC分类】C07K14/435, C12N15/11, C12N15/12
【公开号】CN105111296
【申请号】CN201510614828
【发明人】李冉, 孙金生, 耿旭云, 张亦陈, 田金泽, 朱丽娜
【申请人】天津师范大学
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年9月24日