P5质粒转化细菌IPTG诱导前 裂解液；泳道2为：pET15b-hPP5质粒转化细菌IPTG诱导后裂解液；泳道3为：纯化后的 hPP5-6XHis(六聚组氨酸为纯化用标签，多聚组氨酸也有助于提高穿膜效率）。
[0024] 图6是荧光标记的hPP5 (hPP5_FITC)穿膜进入不同细胞后胞内荧光分布情况，其 中，A为hPP5-FITC穿膜进入HeLa，MG63,ECV-304细胞后胞内荧光分布情况，B为hPP5-FITC 穿膜进入HeLa，MG63,ECV-304细胞后胞内荧光定量以及与经典穿膜肽TAT-FITC比较。
[0025] 图7是hPP5_FITC穿膜进入人外周血单个核细胞后胞内荧光分布情况。
[0026] 图8为不同浓度的hPP5-FITC的穿膜效率。其中，A:ECV-304胞内荧光镜下观察； B:ECV-304胞内荧光定量。
[0027] 图9表示孵育时间、血清对hPP5_FITC入胞的影响，以及细胞活力分析。其中，A: hPP5-FITC短时间孵育后的荧光定量；B:hPP5-FITC长时间孵育后的荧光定量；C:不同浓 度的hPP5对细胞活力影响的定量分析。
[0028] 图10表示不同细胞经DMS0预处理对hPP5-FITC穿膜效率的影响。其中，A:DMS0 预处理不同类型细胞后胞内荧光分布情况；B:DMS0预处理不同培养细胞后的胞内荧光定 量；C:不同DMS0浓度预处理不同类型细胞后胞内荧光分布情况；D:不同DMS0浓度预处理 不同培养细胞后的胞内荧光定量。
[0029] 图11表示pET15b-hPP5_GFP重组质粒构建和NdeI/BamHI的双酶切鉴定。其中， 泳道M为：标准蛋白分子量；泳道1 :PET15b-hPP5-GFP的NdeI/BamHI的双酶切；泳道2 : pET15b-hPP5-GFP。
[0030] 图 12 表示SDS-PAGE分析IPTG诱导pET15b-GFP、pET15b-hPP5-GFP在Rosetta细 菌中的表达及纯化。其中，泳道M为：标准蛋白分子量；泳道3和4分别为：纯化的GFP和 hPP5-GFP融合蛋白；泳道2和5分别为：GFP和hPP5-GFP质粒转化细菌经IPTG诱导；泳道 1和6分别为：GFP和hPP5-GFP质粒转化细菌未经IPTG诱导。
[0031] 图13表示hPP5-GFP融合蛋白穿膜进入L929细胞的分布情况。
[0032] 图14表示hPP5_GFP融合蛋白穿膜进入小鼠脾淋巴细胞的分布情况。
[0033] 图15表示不同温度下荧光短肽在胞内的含量，不同内吞抑制剂对hPP5穿膜效率 影响。其中，A:不同温度下hPP5_FITC穿膜进入胞内荧光定量分析；B:肝素钠处理各种不 同类型细胞后胞内荧光强度；C:氯喹预处理不同培养细胞后胞内荧光强度；D:氯丙嗪处理 不同培养细胞后的胞内荧光强度；E:叠氮化钠处理不同培养细胞后的胞内荧光强度。
【具体实施方式】
[0034] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常 规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次或以上重复实验，结果 取平均值。
[0035]实施例1、CPP-级结构、二级结构分析，预测、鉴定新型人源性CPP:
[0036] 1、对本发明获得的细胞膜穿透肽hPP5的二级结构进行分析，采用了emboss的 在线分析程序（其分析程序请参见网页：http://emboss,bioinformatics,nl/cgi-bin/ emboss/pepwheel在线分析多肽的轮状结构；http://emboss,bioinformatics,nl/ cgi-bin/emboss/help/garnier在线分析二级结构的螺旋、折叠等）。hPP5的轮状结构示意 图，螺旋、折叠结构示意图分别如图3和图4所示。
[0037] 为了便于研究hPP5的细胞穿膜功能：
[0038] 化学合成了绿色荧光标记的hPP5 :
[0039] Phe-Leu-Leu-Asp-Arg-Lys-Lys-Thr-Asp-Lys-Leu-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Arg-L ys-Arg-Arg-FITC
[0040] (hPP5-FITC)；
[0041] 和无绿色焚光标记hPP5 :
[0042] Phe-Leu-Leu-Asp-Arg-Lys-Lys-Thr-Asp-Lys-Leu-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Arg-L ys-Arg-Arg(hPP5,SEQIDN0：l)〇
[0043] 纯化定量、冷冻保存备用。
[0044] 2、hPP5的合成途径有两种：1)化学合成；2)基因工程表达。
[0045] hPP5源于自然蛋白，可以在实验室水平或工业水平进行合成。
[0046]2. 1化学合成方法：此种方法是选择羧基树脂（Fmoc-Tyr(tBu)-Wangresin)，采 用固相Fmoc法合成。hPP5 (苯丙氨酸-亮氨酸-亮氨酸-天门冬氨酸-精氨酸-赖氨酸-赖 氨酸-苏氨酸-天门冬氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨 酸-精氨酸-赖氨酸-精氨酸-精氨酸）具体合成步骤如下：
[0047] (1)用Fmoc基团对a-氨基进行保护的精氨酸通过一个支臂连结到不溶性载体王 氏树脂（Wangresin)上；
[0048] (2)用TFA(二氟乙酸）溶液洗涤精氨酸一支臂一树脂，使a-氨基脱保护；
[0049] (3)将第二个预先用适当的缩合剂DCC活化的a-氨基保护的精氨酸通过耦联反 应与赖氨酸形成共酯连接上去；
[0050] (4)用TFA(三氟乙酸）溶液洗涤赖氨酸一支臂一树脂，使a-氨基脱保护；
[0051] (5)将第三个预先用适当的缩合剂DCC活化的a-氨基保护的赖氨酸通过耦联 反应与精氨酸形成共酯连接上去。重复进行上述脱保护、耦联，直到耦合上最后一个氨基 酸 苯丙氨酸，脱去Fmoc保护基团，合成完成。
[0052] (6)将切割试剂加入到肽一一树脂中，把肽链从树脂上切割下来，同时也将各个氨 基酸上的侧链保护基团从肽链上切割下来，加入乙醚，沉淀多肽，获得多肽粗品。运用HPLC/ MS进行多肽的鉴定和纯化，最终得到所需多肽。
[0053] 2. 2基因工程表达法：采用原核表达方法，具体操作如下：
[0054] ⑴设计编码hPP5的两条单链cDNA，两侧带有NdeI和XhoI酶切位点，交由上 海生工公司合成单链寡聚核苷酸链，再将两条单链DNA等量加入水溶液中，经95°C5min，自 然冷却至室温使其完成退火，形成互补的双链DNA片段（hPP5);
[0055] (2)利用NdeI/XhoI两种限制性内切酶进行双酶切，37°C温育2h，将表达质粒 pET15b(购自Novagen)线性化；
[0056] (3)进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射仪的长波紫外光照射下，切胶回收含线性化 质粒pET15b的条带。瞬时离心，将凝胶集中至管底，依切胶回收试剂盒内的操作说明完成 切胶回收；
[0057] (4)将回收、纯化的线性化质粒DNA片段和退火后经酶切的穿膜肽cDNA片段 (hPP5)分别进行琼脂糖凝胶电泳，确定连接比例，置于16°C水浴箱中温育过夜连接；
[0058] (5)用CaCV法制备DH5a感受态细胞，用热休克法以上述连接产物pET15b_hPP5 转化感受态细胞，经0.lg/L氨苄青霉素琼脂平板37°C过夜筛选后，挑取单菌落接种于含氨 节青霉素LB液体培养基中，37 °C振荡培养过夜；
[0059] (6)离心沉淀收集扩增转化细菌，用碱裂解法提取重组质粒，筛选成功构建的阳性 克隆pET15b_hPP5,酶切并测序验证；
[0060] (7)将验证正确的重组原核质粒pET15b_hPP5转化Rosetta感受态细菌。经0?lg/ L氨苄青霉素琼脂平板37 °C过夜；
[0061] (8)挑取单克隆菌落接种于含氨苄青霉素LB培养基，37°C振荡培养过夜；
[0062] (9)用15ml无菌离心管装3. 8mlAmp⑴LB液体培养基，接种0. 2ml对数生长期的 菌悬液（1:20)。37°C，250rpm继续培养3h;
[0063] (10)于对数生长期细菌培养物中加入40y1 0. 1MIPTG至终浓度1. 0mM，37°C， 250rpm继续培养；
[0064] (11)在加入IPTG后6h取样200y1菌悬液；
[0065] (12)离心收集沉淀，用等体积IXSampleBuffer重悬，沸水浴5min。制备的菌体 全蛋白上样样品；
[0066] (13)SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况，如图5所示确认的重组表达及纯化。
[0067] 3、hPP5具有强穿膜效能：
[0068] 3. 1hPP5_FITC具有显著穿膜特征并在胞内分布均匀；
[0069] 3. 1. 1hPP5_FITC可以穿膜进入体外培养的肿瘤等细胞并在细胞内均匀分布，具 有显著穿膜特征；
[0070] 取对数生长期的三种培养细胞系：ECV-304、HeLa和MG63 (人胚胎血管内皮细胞、 人子宫颈癌细胞和人成骨肉瘤细胞），依1X105个细胞/孔的密度接种于12孔板常规培养， 设实验组及对照组；
[0071] 至对数生长期（80%密度）时，换成无血清的1?^1-1640培养液继续培养111;
[0072] 加入终浓度10yMhPP5-FITC，常规培养lh;
[0073] 弃去培养液，PBS洗涤3次；
[0074] 荧光显微镜下观察培养细胞内荧光及其胞内定位情况。
[0075] 结果见图6,荧光显微镜观察发现，未经hPP5_FITC处理的各种细胞内无绿色荧 光。在经hPP5-FITC温育后，可在胞内见到明显绿色荧光，且这三种不同细胞系均有明显胞 内荧光，提示hPP5穿膜进入细胞没有明显细胞嗜向性。
[0076] 3. 1. 2hPP5_FITC对人外周血单个核细胞有穿膜特征
[0077] 新鲜采取、分离的健康人外周血单个核细胞，依1X105个细胞/孔的密度接种于 12孔板，设实验组及对照组；
[0078] 在培养箱中常规培养2h后，换成无血清的RPMI-1640培养液继续培养lh;
[0079] 加入终浓度10yMhPP5-FITC，常规培养lh;
[0080] 弃去孵育液，PBS洗涤3次；
[0081] 荧光显微镜下观察培养细胞内荧光及其胞内定位情况。
[0082] 结果见图7 :荧光显微镜观察发现，未经hPP5_FITC处理的人外周血单个核细胞内 不见绿色荧光；在经hPP5-FITC温育后，可见到明显的胞内绿色荧光，提示hPP5可高效穿膜 进