入新鲜制备的人外周血单个核细胞。
[0083] 3. 2hPP5_FITC穿膜进入细胞具有浓度依赖性
[0084] ECV-304细胞在经无血清的RPMI-1640处理lh后，加入浓度梯度的 hPP5-FITC(2. 5yM、5. 0yM、7. 5yM、10. 0yM)孵育lh后，PBS清洗 3 次，观察培养细胞内荧 光情况。并采用荧光酶标仪检测细胞内荧光密度数值，具体方法如下：细胞在经不同浓度 hPP5-FITC孵育结束后，PBS清洗3次，按300y1/孔加入0. 1MNaOH，室温裂解细胞lOmin， lOOOrpm离心3min。取细胞裂解液上清50y1于96孔板在荧光酶标仪中，激发光/吸收光 为490nm/520nm下测定荧光密度值。实验重复3次取平均值。在实验中，采用经典的穿膜 肽TAT-FITC作为阳性对照。
[0085] 图8A显示，胞内荧光强度随hPP5_FITC浓度升高而增强，并且可见相同浓度下，胞 内hPP5-FITC荧光比TAT-FITC强。图8B可见，随着hPP5-FITC浓度的升高，胞内荧光强度 随之增强，提示hPP5-FITC穿膜进入细胞具有浓度依赖性。当hPP5-FITC浓度为5yM时， 荧光强度已经比较高，在后续实验中均选用了 5yM的hPP5-FITC作为终浓度进行实验。
[0086] 3. 3hPP5胞内持续时间显著长于TAT
[0087] IfepG2、ECV-304、PC3、HeLa在经无血清的RPMI-1640培养处理lh后，加入终浓度 为 5yM的hPP5-FITC分另IJ孵育 0? 5h、1.Oh、2.Oh、4.Oh、10h、20h及 30h后。PBS洗涤三次， 裂解细胞，依前述方法用荧光酶标仪检测490nm/520nm检测细胞裂解液上清荧光值。实验 均重复3次取平均值。
[0088] 不同的培养细胞随着hPP5_FITC孵育时间的延长，其荧光值均有所增强，至2h其 荧光值为最高（图9A)。为了进一步确定hPP5-FITC在胞内维持时间，将孵育时间延长至 30h。发现hPP5-FITC在IfepG2 (人肝癌细胞株）、ECV(ECV-304细胞株）、PC3 (人前列腺癌 细胞株）和HeLa等细胞系中可以维持至至少30h(图9B)。本研究显示新型人源性细胞膜 穿透肽hPP5在胞内维持时间至少可达30h，而TAT仅能维持短短几小时，显著短于hPP5。
[0089] 3. 4DMS0预处理促进hPP5穿膜进入培养细胞
[0090] 取对数生长期贴壁培养细胞HeLa、MG63、ECV-304,按照1X105个细胞/孔的接种 密度接种于12孔板进行常规培养。每种细胞均分设实验组及对照组；
[0091] 至对数生长期（80%密度）时，换为无血清的RPMI-1640培养液，再培养lh;
[0092] 每孔加入终浓度为5%的DMS0,继续培养lh。加入终浓度为5yM的hPP5-FITC或 TAT-FITC后，孵育lh;
[0093] 弃去培养液，PBS洗涤3次；
[0094] 荧光显微镜下观察HeLa、MG63、ECV-304胞内荧光及其胞内定位情况，或按每孔加 入 300yl0.1MNaOH，室温裂解HeLa、MG63、或ECV-304 细胞 10min，1000rpm离心 3min。取 细胞裂解液上清50y1到96孔板于荧光酶标仪，于490nm/520nm下测定荧光吸光值。实验 重复3次取平均值。
[0095] 本发明人前期研究发现DMS0可以明显增强TAT穿膜效率，在此，也观察了DMS0对 新型人源性细胞膜穿透肽hPP5的穿膜影响。通过荧光显微镜观察发现，DMS0对hPP5-FITC 穿膜具有明显增强效果。经DMS0预处理后，hPP5-FITC在胞内显示高密度绿色荧光，且均匀 分布于胞浆和胞核。荧光定量检测发现，5%DMS0预处理后，hPP5-FITC的胞内荧光强度较 未经DMS0预处理细胞强（图10A-B)，通过对B16、ECV-304细胞的穿膜观察发现，hPP5-FITC 的穿膜效率在一定的范围内具有DMS0的剂量依赖性（图10C-D)。提示5%DMS0预处理细 胞明显促进了hPP5和TAT的穿膜效率，DMS0能够显著增强CPP的穿膜效率且无细胞特异 性（图10)。
[0096] 实施例2、hPP5对细胞活力影响甚微
[0097] (1)取对数生长期培养细胞ECV-304和IfepG2,以1X104个细胞/孔的接种密度 接种于96孔板常规培养，每孔100y1，每种细胞设3个复孔，37°C培养；
[0098] (2)至对数生长期，培养液换成无血清的RPMI-1640培养液，继续培养lh;
[0099] (3)分别换成hPP5浓度梯度为10uM、20uM、30uM、40uM及50uM无血清的 RPMI-1640培养液，继续培养24h;
[0100] ⑷孵育时间结束后，按每孔1〇〇y1加入PBS洗涤，2minX3次；
[0101] (5)每孔加入80yl含血清的正常培养液及20ylMTT(母液浓度5mg/ml，即 0. 5%MTT)溶液，于37°C继续培养4h，终止培养后吸去培养液。以200y1/孔加入二甲基 亚砜，振荡lOmin至结晶物充分溶解后用全波长酶标仪上检测波长为570nm的吸光值A，每 组取3个复孔的平均值。测定0D490。重复3次，计算细胞存活率。
[0102] (6)细胞生存率的计算如下：
[0103] 细胞生存率=(实验孔0D值一对照孔0D值一空白孔0D值）八对照孔0D值一空 白孔0D值）X100%。
[0104] 为明确hPP5处理细胞是否会影响其活力，本实验采用MTT法测定不同浓度hPP5 处理24h后对细胞活力的影响情况。ECV-304和IfepG2细胞经不同浓度hPP5处理后MTT分 析数据显示，浓度高于20yM的hPP5长时间处理细胞后细胞依然保持在75%以上，对细胞 的活力影响甚微（图9C)。这提示有效浓度（小于5yM)范围内hPP5-FITC并不影响细胞 活力。
[0105] 实施例3、pET15b-hPP5-GFP质粒构建，融合蛋白的表达及纯化和其穿膜功效的研 究
[0106] 3. 1pET15b-hPP5-GFP重组质粒的构建和酶切鉴定
[0107] (1)设计编码hPP5的两条单链cDNA，两侧带有NdeI和XhoI酶切位点，交由上 海生工公司合成单链寡聚核苷酸链，再将两条单链DNA等量加入水溶液中，经95°C，5min， 自然冷却至室温使其完成退火，形成互补的双链DNA片段（hPP5);同时设计一对引物以 pEGFP(购自Clontech公司）为模板，PCR获得GFP蛋白基因片段，两侧分别有XhoI和BamH I酶切位点，纯化PCR产物备用；
[0108] (2)利用BamHI/NdeI两种限制性内切酶进行双酶切，37°C温育2h，将表达质粒 pET15b(购自Novagen)线性化；
[0109] (3)进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射仪的长波紫外光照射下，切胶回收含线性化 质粒pET15b的条带；瞬时离心，将凝胶集中至管底，依切胶回收试剂盒内的操作说明完成 切胶回收；
[0110] (4)将回收、纯化的线性化质粒DNA片段和退火后经酶切的编码穿膜肽cDNA片 段（hPP5)、以及经酶切的编码GFP基因片段分别进行琼脂糖凝胶电泳，确定连接比例，置于 16°C水浴箱中温育过夜连接；
[0111] (5)用CaCV法制备DH5a感受态细胞，用热休克法以上述连接产物pET15b-hPP5 转化感受态细胞，经0.lg/L氨苄青霉素琼脂平板37°C过夜筛选后，挑取单菌落接种于含氨 节青霉素LB液体培养基中，37 °C振荡培养过夜；
[0112] (6)离心沉淀收集扩增转化细菌，用碱裂解法提取重组质粒，筛选成功构建的阳性 克隆pET15b-hPP5-GFP，酶切并测序验证；
[0113] 利用NdeI/BamHI双酶切鉴定重组质粒pET15b-hPP5-GFP得到酶切产物理 论值为795bp(图11)，片段与预期大小一致；经测序确认无突变。说明原核表达质粒 pET15b-hPP5-GFP构建成功。再用相同方法构建得到pET15b-GFP和pET15b-TAT-GFP。
[0114] 3. 2融合蛋白的表达及纯化
[0115] 3. 2. 1融合蛋白的原核表达
[0116] (1)将成功构建的重组质粒pET15b-GFP和pET15b-hPP5-GFP分别转化Rosetta感 受态细胞。经0.lg/L氨苄青霉素琼脂平板37 °C过夜；
[0117] (2)挑取单克隆菌落接种于含氨苄青霉素LB培养基，37°C振荡培养过夜；
[0118] (3)用15ml无菌离心管装3. 8mlLB(+)Amp液体培养基，接种0. 2ml对数生长期的 菌悬液（1:20)。37°C，250rpm继续培养3h;
[0119] (4)于对数生长期细菌培养物中加入40y1 0? 1MIPTG至终浓度1.0mM，37°C， 250rpm继续培养；
[0120] (5)在加入IPTG后6h取样200y1菌悬液；
[0121] (6)离心收集沉淀，用等体积IXSampleBuffer重悬，沸水浴5min。制备的菌体 全蛋白上样样品；
[0122] (7)SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况。
[0123] 3. 2. 2融合蛋白的纯化
[0124] 3. 2. 2. 1大量诱导：用1L培养瓶中盛300mlLBG)-液体培养基，诱导表达可溶性 的重组蛋白（l.OmMIPTG，30°C，250rpm，9h)。4°C6500rpmX10min，收集沉淀并称重，-40°C 保存备用。
[0125] 3. 2. 2. 2 咪唑纯化
[0126] (1)超声裂解：平均 100ml菌液用 15mlLysis/BindingBuffer(300mMNaCl，50mM NaH2P04,lOmM咪唑，pH8. 0)重悬，冰浴。超声功率300~600W，超声2sec，间隔2sec，工作 90次。如此循环12~20次，至均匀破碎细菌于悬浮溶液；
[0127] (2) 12000rpmX20min，4°C，转移上清至 15ml离心管中；
[0128] (3)结合：用3~5倍体积的Lysis/BindingBuffer在15ml离心管中平衡 Ni-NTA，离心收集Ni-NTA，再用与沉淀等体积的Lysis/BindingBuffer重悬，即已平衡的 50%Ni-NTA。取1~4ml50%Ni-NTA与裂解上清混合，在分子杂交炉中37°C转动结合1~ 2h；
[0129] ⑷洗涤脱除杂蛋白：用至少1/2菌液体积的WashBuffer(300mMNaCl，50mM NaH2P04, 20~30mM咪挫，pH8. 0)洗脱杂蛋白。收集前3~5ml穿柱液，取样备做检测；
[0130] (5)洗脱靶蛋白：