行突变，最终得到的DNA序列可表达为本发明所述的对胰蛋白酶抗性提高的0-1，4-内 切木聚糖酶。
[0079] 实施例5:野生型XynA与突变体XynA_/R1°lsS因分别导入大肠杆菌BL21 (DE3)及 重组蛋白的IPTG的诱导表达
[0080] 1.将含量为200ng的野生型XynA质粒和重组XynAK68Q/R1°ls质粒分别加入至含 200yL感受态细胞的1. 5mL离心管中，轻轻旋转混匀，冰浴30分钟；42°C热击90sec。取出 立即冰浴3分钟，加入600yL的LB液体培养基，37°C，75rpm，缓慢摇动lh。将感受态细胞 涂布于Amp+的LB固体培养基上，每个直径90mm的平板涂布200yL，37°C培养12h，抽提重 组质粒，用EcoRI和Hindlll酶切鉴定重组质粒。
[0081] 2.重组蛋白的诱导表达
[0082] 按照探索好的条件诱导表达蛋白酶：
[0083] (1)分别取50yL甘油保存的野生型重组菌，分别接种于1支5mL的含100yg/mL Amp的LB液体培养基中，37°C，250rpm过夜培养。
[0084] (2)过夜培养物按照1:100的比例接种2. 5mL于含100yg/mLAmp的250mL的LB 液体培养基中，37°C，250rpm培养至0D6。。为1. 0时加入IPTG至终浓度为0. 5mM，37°C250rpm 振荡培养，4h后收菌。
[0085] 实施例6:野生型XynA及突变体XynA_/R1°ls重组蛋白的纯化及SDS-PAGE电泳检 测
[0086] 1.使用超声波细胞破碎仪对菌体进行细胞破壁，破壁前加入DEAE阴离子层析平 衡缓冲液至25mL对菌液进行重悬。待菌液破壁完全澄清后，破碎液4°C10000g离心10分 钟，收集上清即为蛋白样品粗提物，蛋白粗提物经过阴离子层析和Ni离子层析进行纯化， 得到的Ni离子层析的洗脱峰经硫酸铵沉淀过夜后，用分子筛G-25脱盐，得到纯蛋白，步骤 如下：
[0087] (1)首先用pH7. 4的0? 02mol/LNaH2P04缓冲液平衡层析柱2-3个柱体积。
[0088] (2)待基线平衡后，以0? 5mL/分钟的流速上样。
[0089] (3)上样结束后，以同样的流速，分别用平衡缓冲液和含lmol/LNaCl的洗脱缓冲 液洗脱，280nm紫外吸收法检测，收集得到的淋洗峰和洗脱峰。
[0090] (4)阴离子交换层析得到的淋洗峰作为Ni离子层析的上样样品。首先用PH6. 5的 含0? 02m〇l/LNaH2P0jP0? 5mol/LNaCl的缓冲液平衡层析柱2个柱体积。
[0091] (5)然后以0? 5mL/分钟的流速上样。
[0092] (6)再以相同的缓冲液，0. 5mL/分钟的流速洗脱2个柱体积。
[0093] (7)最后用含lOOmM咪唑的洗脱缓冲液，以0. 5mL/分钟的流速洗脱1. 5个柱体积， 280nm紫外吸收法检测并收集所出的洗脱峰。
[0094](8)洗脱峰经80%饱和硫酸铵沉淀后用511^口117.4的0.02111〇171^&11 2?04缓冲液 溶解。
[0095] (9)进行阳离子交换层析。
[0096] (10)收集得到的酶液，进行蛋白含量和酶活性的测定。将收集到的酶液取lmL用 91^95%酒精-20°(：沉淀过夜，离心干燥蛋白后，进行303^^6￡分析。
[0097] 2.SDS-PAGE电泳检测
[0098] (1)配置10mL15%的分离胶，混匀后用移液枪往玻板中灌胶，直到离短玻板顶部 2~3厘米处停止，然后用蒸馏水封住胶面，可轻轻抬起制胶器一端然后放下使胶面平整， 聚合40分钟后到弃蒸馏水，用滤纸吸去多余水分；
[0099] (2)配置4mL5%的浓缩胶，均匀的灌在分离胶之上，插入相应规格的梳子同时应 避免产生气泡，聚合30分钟待胶凝固；
[0100] (3)装好电泳槽，在槽内灌电泳缓冲液，体积宜大于电泳槽体积的一半，把制好的 胶移入电泳槽中，小心拔去样品梳子；
[0101] ⑷依次点样，点样量不宜过多，15iiL每孔为合适；
[0102] (5)电泳开始时先设置120V跑胶，指示剂至浓缩胶部分将电压改为180V继续电 泳，目的条带跑到中间位置时可停止电泳；
[0103] (6)小心剥下凝胶，考马斯亮蓝R-250染色30分钟后，脱色液脱色至背景较浅蛋白 条带清晰即可；
[0104] (7)凝胶成像并观察结果。
[0105] 由电泳检测结果：在20. 4KD处得到单一的蛋白条带，如图2。表明样品经纯化后 得到XynAK68Q/R101s〇
[0106] 实施例7 :野生型XynA及突变体XynAK6SQ/_^组蛋白的胰蛋白酶抗性检测
[0107] 1.纯化后的酶液与人工模拟肠液（pH6. 810mg/mL胰蛋白酶溶液）按照质量比 10:1混合，于37°C保温，每隔30分钟取样，DNS法测定酶活力，以胰蛋白酶溶液处理0分钟 的酶液活力为100%，计算各组酶的相对活力，考查野生型酶在胰蛋白酶中的稳定性。实验 共进行3批次的培养，每批每个样品设2个平行进行测量，残余酶活力取6个测量数据的 平均值。
[0108] 2?酶活力测定：
[0109] 本实验采用DNS法进行木聚糖酶活性的测定，此法的原理是利用DNS(3, 5 -二硝 基水杨酸）溶液与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物（见图3)，并且在一 定范围内生成的棕红色氨基化合物与体系中还原糖的量成正比关系，因此可用比色测定酶 活，该法具有操作简便，快速，且杂质干扰少的优点。具体酶活力测定包括标准曲线的制作， 样品活性组及样品灭活组的制作。
[0110] (1)标准曲线的制作
[0111] 标准木糖溶液浓度：lmg/mL
[0112] 取96孔板一个，按下表依次进行，做出标准曲线，如下表：
[0113]
[0114] ⑵木聚糖酶活力的测定（DNS法）
[0115] 将燕麦木聚糖以质量分数1 %的浓度，溶解于pH6. 0的0. 04m〇L/L Na2HP04-0 . 02m〇L/L柠檬酸缓冲液，做为底物。酶溶液也用相同的缓冲液适当稀释。取70yL 底物溶液加10yL稀释过的酶溶液，60°C反应10分钟，加入200yL的DNS试剂终止反应， 100°C显色10分钟，冷却后，于540nm处测量反应液的光吸收值，根据标准曲线计算生成的 还原糖的量，同时做底物+灭活酶的对照。
[0116] 木聚糖酶的活力单位（M)定义为：在上述测活条件下，每分钟水解木聚糖生成 lymoL木糖所需要的酶量。
[0117]计算公式为：Ea=NXVCX6. 667AV2XT)
[0118] 式中：Ea为木聚糖酶的酶活力，M/mL;
[0119]N:酶液的稀释倍数；
[0120] V」反应液的最终体积，mL;
[0121] C:从标准曲线上计算得出的木糖的浓度，mg/mL;
[0122] (C=活性组还原糖含量一灭活组还原糖含量）
[0123]V2:反应液中酶液的体积，mL;
[0124]T:酶解反应的时间，分钟；
[0125] 6. 667 :换算系数（将mg/mL转换为ymoL/mL)。
[0126] 3.XynA及突变体XynAK6SQ/_^组蛋白在胰蛋白酶溶液中的稳定性
[0127] 在37°C用人工模拟肠液处理野生型和突变体，每隔30分钟取样测野生型和突变 体的残留酶活力，结果表明：XynAK6SQ/R1°ls的残留酶活力明显比野生型XynA高，如图3。对 野生型及突变体在胰蛋白酶溶液中稳定性的半衰期作图分析，XynA的半衰期为127分钟； XynA_/R1°ls的半衰期为287分钟，比野生型延长了 160分钟。
【主权项】
1. 一种对胰蛋白酶抗性提高的0 -1，4-内切木聚糖酶，其特征在于：它是由氨基酸序 列为SEQ ID NO. 1的(6-1,4-内切木聚糖酶中制造两个氨基酸取代而产生的，对胰蛋白酶 抗性更强的P -1，4-内切木聚糖酶，所述的氨基酸取代是第68位和101位的取代。2. 根据权利要求1所述的对胰蛋白酶抗性提高的P -1，4-内切木聚糖酶，其特征在于： 所述在第68位的氨基酸取代是用谷酰胺取代赖氨酸；在101位的氨基酸取代是用丝氨酸取 代精氨酸；所述的定点突变改造的0 -1，4-内切木聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。3. -种DNA分子，其特征在于：其编码权利要求2所述的对胰蛋白酶抗性提高的 0-1，4-内切木聚糖酶。4. 根据权利要求3所述的DNA分子，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO. 3。5. -种载体，其特征在于：其含有权利要求3或4所述的DNA分子。6. -种宿主细胞，其特征在于：其含有权利要求3或4所述的DNA分子，或者含有权利 要求5所述的载体。7. -种根据权利要求1所述的对胰蛋白酶抗性提高的P -1，4-内切木聚糖酶的生产方 法，其特征在于，所述方法包括：在适于P -1，4-内切木聚糖酶表达的条件下培养权利要求 6所述的宿主细胞，并从菌体中分离所述的P -1，4-内切木聚糖酶。8. 根据权利要求1所述的胰蛋白酶抗性提高的P -1，4-内切木聚糖酶在饲料和食品中 的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种对胰蛋白酶抗性提高的β-1,4-内切木聚糖酶。该酶是由氨基酸序列为SEQ？ID？NO.1的β-1,4-内切木聚糖酶中制造两个氨基酸取代而产生的，对胰蛋白酶抗性更强的β-1,4-内切木聚糖酶，所述的氨基酸取代是第68位和101位的取代。本发明通过蛋白质工程技术对XynA分子的关键氨基酸残基进行了改造，提供了一种对胰蛋白酶抗性提高的XynA突变体，其对胰蛋白酶的抗性半衰期比野生型XynA延长了160分钟，其他酶学性质与野生型酶基本一致，该突变体酶可用于做饲料添加剂。
【IPC分类】C12N15/56, C12N9/42
【公开号】CN105112388
【申请号】CN201510567342
【发明人】姚冬生, 吴秀秀, 谢春芳, 刘大岭
【申请人】暨南大学
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年9月8日