对胰蛋白酶抗性提高的β-1,4-内切木聚糖酶及其制备方法与用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及0-1，4-内切木聚糖酶，特别涉及到对胰蛋白酶抗性提高的 0-1，4-内切木聚糖酶。
【背景技术】
[0002] 木聚糖是半纤维素中含量最丰富的组分之一，在植物细胞壁中的含量仅次于纤维 素，约占细胞干重的35%。广泛存在于农业副产品如玉米芯、麦麸、米糠、秸杆、甘蔗渣等之 中，是一种重要的饲料原料。
[0003] 木聚糖的主链由0 -D-木糖残基经0 -1，4-糖苷键连接，侧链上连有多种不同类 型的取代基，比如主链木糖残基的C-2、C-3位可单独或同时发生乙酰化等，其化学结构见 图1。
[0004] 木聚糖的完全降解需要多种水解酶的共同参与，0 -1，4内切木聚糖酶能够以内切 方式作用于木聚糖主链产生不同长度的木寡糖和少量的木糖，木聚糖酶是木聚糖降解酶中 最关键的酶。
[0005] 动物对木聚糖的利用是在包括木聚糖酶在内的多种饲料用酶的作用下分解成寡 糖和单糖之后吸收。
[0006] 饲料用酶是在进入养殖动物消化道之后发挥作用的，在消化道中的蛋白酶对饲用 酶的分解是影响饲用酶使用效率的重要原因，所以，具有蛋白酶抗性是饲用酶十分重要的 性质。
[0007]目前，广泛使用的木聚糖酶对胰蛋白酶的抗性都较低，作为饲料用酶，其在动物消 化道内受到胰蛋白酶的分解，作用效果受到了明显的影响。
【发明内容】
[0008] 本发明的首要目的是提供一种对胰蛋白酶抗性提高的0-1，4-内切木聚糖酶，它 是通过蛋白质工程技术对XynA分子的关键氨基酸残基进行改造后得到的一种对胰蛋白酶 抗性提高的XynA突变体，克服作为饲料用酶的木聚糖酶对胰蛋白酶抗性差的缺点，提高木 聚糖酶作为饲料用酶的使用效果和价值。
[0009] 本发明是对0 -1，4-内切木聚糖酶的基因（称为XynA基因）进行定点突变。由枯 草芽孢杆菌（Bacillussubtilis)中获得的f3-l，4-内切木聚糖酶，已经被测序，GENBANK 登录号为CP010052. 1。该酶的成熟蛋白的氨基酸序列为SEQIDN0. 1。
[0010] 根据本发明所述的一种定点突变改造的XynA，是由氨基酸序列为SEQIDNO. 1 的0-1，4-内切木聚糖酶中制造多个氨基酸取代而产生的，对胰蛋白酶抗性提高的 0 -1，4-内切木聚糖酶，所述的氨基酸取代是第68和101位的取代。
[0011] 根据本发明所述的定点突变改造的0 -1，4-内切木聚糖酶的进一步特征，所述在 第68位的氨基酸取代是用谷酰胺取代赖氨酸；在101位的氨基酸取代是用丝氨酸取代精氨 酸；所述的定点突变改造的0 -1，4-内切木聚糖酶的氨基酸序列为SEQIDNO. 2。
[0012] 本发明所述的作用于木聚糖的突变体P-1，4-内切木聚糖酶（XynA_/R1°ls)，经人 工肠液（pH6.0，lmg/mL胰蛋白酶溶液）处理，其对胰蛋白酶的抗性半衰期比野生型酶延长 了 160分钟，其他酶学性质与野生型酶基本一致。
[0013] 进一步地，本发明提供了一种DNA分子，其编码本发明所述的对胰蛋白酶抗性提 高的0-1，4-内切木聚糖酶。
[0014] 优选地，本发明所述的DNA分子的核苷酸序列为SEQIDN0. 3。
[0015] 本发明的另一个目的是提供一种载体，其含有本发明所述的DNA分子。
[0016] 本发明的又一个目的是提供一种宿主细胞，其含有本发明所述的DNA分子，或者 含有本发明所述的载体。
[0017] 上述载体和宿主细胞都可以通过本领域公知的技术手段进行制备。
[0018] 本发明还提供了本发明所述的对胰蛋白酶抗性提高的0-1，4-内切木聚糖酶的 生产方法，包括：在适于0 -1，4-内切木聚糖酶表达的条件下培养本发明所述的宿主细胞， 并从宿主细胞中分离所述的0-1,4-内切木聚糖酶。
[0019] 当本发明所述的DNA分子以合适的取向和正确的阅读框插入到所述的载体，或者 转入所述的宿主细胞中，所述的DNA分子可以在相应的原核表达系统中表达。许多宿主-载 体系统都可以用来表达蛋白质编码序列。宿主_载体系统包括但不限于：用噬菌体、质粒或 粘粒转化的细菌；含有酵母载体的微生物，如酵母；用病毒感染的哺乳动物细胞系统；用病 毒感染的昆虫细胞系统；用细菌感染的植物细胞系统。本发明优选的载体包括病毒载体、质 粒、粘粒或者寡核苷酸。
[0020] 本发明优选的宿主为原核系统如大肠杆菌BL21(DE3);本发明优选的蛋白质表达 方法为IPTG诱导表达。
【附图说明】
[0021] 图1是木聚糖的化学结构。
[0022] 图2为纯化后的XynAK68Q/R101SSDS-PAGE电泳检测图，其中，M为分子量Marker; 1为纯化后的XynAK68Q/R101S样品。
[0023] 图3为采用DNS法进行木聚糖酶活性的测定的原理图。
[0024] 图4显示野生型及其突变体在胰蛋白酶溶液中的残留活性。
【具体实施方式】
[0025] 本文中所采用的术语，除非另有说明，均为本领域技术人员所通常理解的含义。以 下提供在本发明中使用的一些特殊术语的定义。
[0026] "wtXynA"表示野生型0-1，4-内切木聚糖酶，其基因以斜体wtXynA表示。
[0027] "XynAK6SQ/R1〇ls" 表示突变体 0 -1，4-内切木聚糖酶XynAK6SQ/R1〇ls，其基因以XynAK6SQ/ R101S主二 表；
[0028] 实施例1 : 0 -1，4-内切木聚糖酶基因的PCR扩增和测序
[0029] 1、本发明以枯草芽孢杆菌来源的0 -1，4-内切木聚糖酶基因（GENBANK: CP010052.1)序列作为参考，采用软件Primer5设计并合成两条寡核苷酸引物，试剂盒法 提取枯草芽孢杆菌中的基因组，通过PCR法扩增XynA目的基因。
[0030] 两条PCR引物如下：
[0031]正向引物F(SEQIDN0. 4):
[0032] 5'CGGAATTCATGTTTAAGTTTAAAAAGAATTTCT3'；
[0033]反向引物R(SEQIDNO. 5):
[0034] 5,CCAAGCTTTTACCACACTGTTACGTTAGA3，。
[0035]PCR扩增XynA基因的反应体系如下：
[0036]
[0037]
[0038] PCR程序设定为：
[0039] 94 °C预变性2分钟；
[0040] 4°C，30s;56°C，30s;，68°C，1 分钟；30 个循环；
[0041] 68 °C，5 分钟。
[0042] PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后，用DNA回收试剂盒进行胶回收，得到大 约650bp的片段。
[0043] 实施例2 :0-1，4-内切木聚糖酶基因（XynA)的TA克隆
[0044] 1.在一个新的灭菌的PCR管中加入下列成分：
[0045]
[0046] 抽吸混匀并短暂离心，16°C水浴过夜。
[0047] 连接产物转化DH5a感受态细胞扩增后用质粒抽提试剂盒抽提质粒，用PCR鉴定 重组质粒，把PCR验证为阳性的菌株取菌液送样Invitrogen公司测序，确定测序成功。
[0048] 实施例3 :pET32a_XynA重组质粒的构建及转化
[0049] 1.EcoRI、Hindlll双酶切重组pMD18_T载体和载体pET32a;
[0050] 表 1EcoRI、HindIII双酶切pMD18-T-XynA和pET32a(单位：yL)
[0051]
[0052] 37 °C双酶切30分钟后，1. 5 %琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。
[0053] 2.酶切产物切胶回收，将酶切纯化回收的pET32a载体和目的基因XynA以浓度比 1:3-1:10的比例混合，16 °C过夜连接。
[0054] 表2双酶切pET32a载体片段和XynA插入片段的连接：（单位：yL)
[0055]
[0056] EcoRI和HindIII酶切鉴定重组质粒后，把验证为阳性的菌株取菌液送样 Invitrogen公司测序，确定测序成功。
[0057] 实施例4 :定点突变
[0058] 1、经过利用酶促反应理论和蛋白分子之间相互识别的原理，对以下位点的氨基酸 进行定点突变：
[0059] (1)对于第68位氨基酸的氨基酸突变，设计引物如下：
[0060] XynAK68Q
[0061] 正向突变引物（SEQIDNO. 6):
[0062] 5'GGAAATTTTGTTGTTGGTOAAGGTTGGACTACAGG3'
[0063] 反向突变引物（SEQIDNO. 7):
[0064] 5'CCTGTAGTCCAACCTTG*ACCAACAACAAAATTTCC3'
[0065] 其中*为突变碱基，引物交由北京奥科生物技术有限公司合成。
[0066] (2)对于第101位氨基酸突变，设计引物如下：
[0067] XynAR101s
[0068] 正向突变引物（SEQIDNO. 8):
[0069] 5'CTTTATATGGTTGGACGAGOTCACCTCTC3'
[0070] 反向突变引物（SEQIDNO. 9):
[0071] 5,GAGAGGTGAG*CTCGTCCAACCATATAAAG3，
[0072] 其中*为突变碱基，引物交由北京奥科生物技术有限公司合成。
[0073] PCR程序设定为：
[0074] 94 °C预变性2分钟；
[0075] 94。(：，30s;63。(：，30s;68。(：，65s;5 个循环；
[0076] MX：，3〇s;59。(：，3〇s;68。(：，65s;25 个循环；
[0077] 68 °C，5 分钟。
[0078] PCR反应后连接测序。基因定点突变是采用重叠延伸PCR的方法，依次对2个位点 进