D-Plus) : 10XPCRBuffer(5uL)，2mM dNTPs(5uL)，2mMMgS04 (2uL)，引物（各 1. 5uL)，DNA(2uL)，KOD-Plus(luL)，dH20 (32uL)。
[0046] 步骤二：按照以下程序进行PCR反应：预变性92°C，2min;变性94°C，15S(2-4步， 30 个cycle);退火 56. 5°C，30S;延伸 68°C，1. 5min;保存 4°C，。
[0047] 步骤三：PCR产物于1 %的琼脂糖凝胶电泳中检测（如图1所示），利用胶纯化试 剂盒（购自Axygen公司）回收片段，将回收的片段克隆至PMD19-Tsimplevector(购 自TaKaRa公司）中，转化大肠杆菌BL21感受态中，挑取单菌落，培养，测序，测序后根据 BLASTN查看同源性比例，由于微生物基因间同源性较高，因此若得到的序列与大肠杆菌序 列同源性高，则确定为肠杆菌的deoA基因，引物序列见SeqIDN0. 3、4。
[0048] 实施例2 :基因deoA在大肠杆菌BL21中的表达分析
[0049] (1)设计特异性引物，加入酶切位点Ndel和Xbal及保护碱基，以克隆获得的deoA 基因为模板，扩增deoA基因，特异性引物为：
[0050]SeqIDN0.5:上游引物 5' -CACATTTCCCCCGATTCC-3'；
[0051]SeqIDN0.6:下游引物 5' -ATGTGGCCCATGGTATCAG-3'。
[0052] (2)进行PCR扩增，产物回收，及TA克隆至PMD19-Tsimplevector，测序，具体操 作同上），选择含有正确扩增序列的菌液，利用质粒提取试剂盒（购自Axygen公司）回收 质粒。利用限制性内切酶Ndel和Xbal对含有基因的T载体和原核表达载体pCold进行 双酶切，琼脂糖胶检测回收片段，用T4DNA连接酶对切割后的载体和基因进行连接，构建的 PCold-deoA重组载体，将重组载体转入大肠杆菌BL21感受态，阳性单克隆送公司测序。
[0053] (3)重组蛋白的原核表达：将含有正确重组质粒的细菌于37°C培养至0D= 0. 6， 保存部分菌株作为诱导前样品，另一部分菌株用ImMIPTG，30°C诱导6h，菌液离心收集，一 部分作为诱导后总样品，另一部分3s/5S间歇超声10min，破碎细胞以释放蛋白质，离心沉 淀作为一部分样品，上清作为可溶性样品，利用SDS-PAGE对正确含有基因的4份大肠杆菌 BL21样品进行目的蛋白的可溶性鉴定。
[0054] (4)表达产物的SDS-PAGE分析：SDS-PAGE电泳按常规方法进行。
[0055]如图 2 所示，marker从上至下分别是 116. 0KD、66. 2KD、45. 0KD、35. 0KD、25. 0KD、 18. 4KD、14. 4KD，每张基因图从左往右分别是marker、诱导前对照、诱导后菌的总蛋白、总蛋 白经超声波裂解后的沉淀、总蛋白经超声波裂解后的上清。deoA大小为47KD，对比marker， 大肠杆菌BL21经6h诱导都在预测位置出现浓厚的条带，获得的蛋白大小正确，而作为阴 性对照的诱导前大肠杆菌BL21则无此条带。同时对诱导的蛋白进行可溶性鉴定结果表明， deoA蛋白在大肠杆菌BL21的超声波裂解上清与沉淀中同时存在特异性条带，说明表达的 deoA蛋白部分可溶，为有功能的蛋白，部分不溶，为无功能蛋白。
[0056] (5)原核表达菌株耐草甘膦的能力：
[0057] 对能够可溶性表达功能蛋白的大肠杆菌过夜培养，取相应的体积于1. 5ML的离心 管，并加入新的培养，同时施加草甘膦的逆境，各溶液的体积比为V培养液：V草甘膦：V菌 液=200 :1 :20,以空载为对照，30°C，150rpm震荡培养24h，利用分光光度计测量0D600,3 次重复取平均值。如图3所示，含有deoA基因的E.Coli的0D600大于对照CK，说明deoA 对微生物耐草甘膦具有一定的作用。
[0058] 实施例3:基因deoA在拟南芥中的表达分析
[0059] (1)选择pMDC83(南京农业大学国家大豆改良中心提供）作为植物过量表达载 体，该载体的抗性筛选为潮霉素，便于转基因苗的筛选；deoA基因的植物表达载体构建参 照Gateway试剂盒说明操作。
[0060] (2)根据肠杆菌耐草甘膦基因deoA的序列，设计扩增编码完整阅读框的引物，并 在上、下游引物引入gateway接头序列：
[0061]SeqIDN0.7:上游引物如下
[0062] 5' -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGGGGTTACCGTGTTT-3'；
[0063]SeqIDN0.8:下游引物如下
[0064] 5' -CGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTCAGTGATGCGGCGATA-3'；
[0065] (3)以实施例1中获得的PCR扩增产物为模板，进行PCR扩增，具体操作同实 施例1，将deoA基因克隆至入门载体pD0N0RTM/zeo(BP反应），进一步克隆至表达载体 PMDC83(LR反应）。
[0066]BP反应：离心管中加入4uL含有接头的基因，luLpDONORTM/zeo载体（抗zecion， 3K)，3uLdH20,2uLBPclonaseTMIIenzymemix，轻轻混勾；25°C温育 16h，加入luL蛋白 酶K，37°C温育lOmin，终止反应；连接产物转化E.coli;挑取阳性单克隆，培养测序，选取正 确含有目的基因的菌株提取质粒，用于LR反应。
[0067]LR反应：2uL正确的入门载体质粒，2uLPMDC83(卡那抗性，12513bp)，4uLdH20， 2uLBPclonaseTMIIenzymemix，轻轻混勾；25°C温育 16h，加入luL蛋白酶K，37°C温育 10min，终止反应；连接产物转化E.coli;挑取阳性单克隆，培养测序，选取正确含有目的基 因的菌株提取质粒。
[0068] (4)将正确含有目的基因的植物表达载体利用滴花法转化拟南芥，具体步骤如 下：
[0069] 步骤一：将达到盛花期的拟南芥上已有的种子剪去；
[0070] 步骤二：将含有正确目的基因的植物表达载体的农杆菌接种于50mL的含有卡那 和利福平的YEB培养基中培养，28°C培养过夜；4°C，5000rpm，离心10min，弃上清；用侵染液 (5%的蔗糖，起能量和黏着的作用，不加抗生素的MS液体培养基，0. 01-0. 03%的表面活性 剂silwetRu77)悬浮沉淀，4°C，5000rpm，离心10min，弃上清；重复一次；加入侵染液悬浮沉 淀至 0D600 为 1. 2-1. 6;
[0071] 步骤三：用移液器将农杆菌悬浮液滴到拟南芥花蕾上；
[0072] 步骤四：侵染后的拟南芥于暗室中培养24h;
[0073] 步骤五：侵染植株正常培养，至角果成熟，收集种子；
[0074] (5)阳性转基因苗的筛选，具体步骤如下：
[0075] 步骤一：将转基因拟南芥种子加dH20(没过种子），置于4°C冰箱，春花2-3天；
[0076] 步骤二：纯化后的种子用70%的乙醇清洗lmin，10%的NaCIO清洗8min;将灭过 菌的种子用dH20洗6-8遍；将种子布于含有潮霉素（终浓度50mg/L)的MS培养基中，封 上封口膜，置于光照培养箱中；若为成功转入重组质粒的种子，能够在培养基中长出4片真 叶，且根系较长，非转基因的植株叶片无法正常展开且根系几乎不生长或极短；待植株4片 叶子完全展开，将苗转至土壤中继续培养；
[0077] 步骤三：待植株有较多叶片时，取叶片提取RNA，利用植物RNA提取试剂盒（购自 天根）提取转基因拟南芥总RNA，总RNA利用反转录试剂盒（购自TaKaRa)合成cDNA;利用 基因特异性引物（SeqIDN0. 3、4)检测基因是否导入拟南芥；如图4所示，对T3代阳性拟 南芥对潮霉素的耐性检测结果表明，与对照相比T3代转基因苗无受潮霉素抑制的苗，说明 转基因拟南芥已达纯合，对纯合的T3代植株再次进行PCR检测。
[0078] 步骤四：对转基因拟南芥进行PCR鉴定，如图5所示，对T3代纯合阳性拟南芥的分 子鉴定，利用微生物克隆基因的引物对转基因拟南芥进行扩增，因为植物基因组中不存在 同源序列，因此有条带即说明微生物基因已整合至拟南芥基因组中。结果表明deoA基因已 成功整合到拟南芥基因组中，并且能够在拟南芥中稳定遗传。
[0079] (6)对转基因拟南芥进行耐性评价，具体步骤如下：
[0080] 步骤一：将纯合的转基