后，加入一抗(I: 3000)进行室温孵育。二抗为辣根酶标记羊抗小鼠IgG(l: 4000)孵育清洗后，进行ECL发光检测，如图3所示。
[0022]4.超声破碎大量自动诱导培养(方法同前，试剂按比例扩大)收集的菌体制备可溶蛋白，超声破碎参数为功率300W，间隔时间10S，破碎时间10S，总时间20min。16000转/分钟离心20min后取上清，然后用镍柱纯化带有His-Tag标签的重组蛋白Fn3-Gly_loop。
[0023]实施例2
[0024]1.本实施例采用人纤维连接蛋白III型结构域(Fn3)蛋白为模式基因(EMBL登入号码AJ320527)。在基因的5'末端引入编码6个组氨酸残基，在FG loop区引入编码糖基化位点DQNAT的碱基序列，融合基因结构见图1。将基因通过基因重组构建到PIG6H，载体结构见图2。
[0025]2.将序列表所示的人纤维连接蛋白III型结构域突变体Fn3-Gly-loop基因表达框序列合成后(南京金斯瑞生物科技有限公司)，用EcoRV和HindIII构建到大肠杆菌表达载体pIG6H上，得到重组载体pIG6H-Fn3_Gly-loop。
[0026]3.将构建的表达载体及pACYCpgl电击转化CLM37大肠杆菌菌株，然后将转化子接种到含有氨节青霉素(100微克每晕升)和氯霉素(37微克每晕升)的LB固体培养基(每升培养基中含胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化钠10克和15克琼脂粉)平板上，过夜24小时培养。筛选出单克隆后将其接种到含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每_升)的LB液体培养基，过夜16小时培养。次日，以1:100接种到10晕升含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)的LB液体培养基的三角瓶中，200印111、37°(:培养，直至006。。达到0.6。然后，以1:100接种到100毫升含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)自动诱导培养基中，在30°C、200rpm条件诱导表达24小时。在此过程，在大肠杆菌胞内表达重组蛋白Fn3-Gly。自动诱导培养基的配方如下:每升培养基中含有以下重量的各组分:胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，甘油5克，葡萄糖0.5克，乳糖2克，磷酸氢二钠7.1克，磷酸二氢钾6.8克，硫酸铵3.3克，硫酸钠0.9克，七水硫酸镁0.25go
[0027]将获得的重组蛋白Fn3-Gly_loop通过Western Blot方法测定糖基化效率。取0.50D菌用裂解液加热裂解，SDS-PAGE电泳后湿转至PVDF膜上，经过封闭后，加入一抗(I: 3000)进行室温孵育。二抗为辣根酶标记羊抗小鼠IgG(l: 4000)孵育清洗后，进行ECL发光检测，如图4所示。
[0028]4.超声破碎大量自动诱导培养(方法同前，试剂按比例扩大)收集的菌体制备可溶蛋白，超声破碎参数为功率300W，间隔时间10S，破碎时间10S，总时间20min。16000转/分钟离心20min后取上清，然后用镍柱纯化带有His-Tag标签的重组蛋白Fn3-Gly_loop。
[0029]实施例3
[0030]1.本实施例采用人纤维连接蛋白III型结构域(Fn3)蛋白为模式基因(EMBL登入号码AJ320527)。在基因的5'末端引入编码6个组氨酸残基，在FGloop区引入编码糖基化位点DQNAT的碱基序列，融合基因结构见图1。将基因通过基因重组构建到PIG6H，载体结构见图2。
[0031]2.将序列表所示的人纤维连接蛋白III型结构域突变体Fn3-Gly-loop基因表达框序列合成后(南京金斯瑞生物科技有限公司)，用EcoRV和HindIII构建到大肠杆菌表达载体pIG6H上，得到重组载体pIG6H-Fn3_Gly-loop。
[0032]3.将构建的表达载体及pACYCpgl电击转化CLM37大肠杆菌菌株，然后将转化子接种到含有氨节青霉素(100微克每晕升)和氯霉素(37微克每晕升)的LB固体培养基(每升培养基中含胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化钠10克和15克琼脂粉)平板上，过夜24小时培养。筛选出单克隆后将其接种到含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每晕升)的LB液体培养基，过夜16小时培养。次日，以1:100接种到10晕升含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)的LB液体培养基的三角瓶中，200印111、37°(:培养，直至006。。达到0.6。然后，以1:100接种到100毫升含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)自动诱导培养基中，在35°C、200rpm条件诱导表达24小时。在此过程，在大肠杆菌胞内表达重组蛋白Fn3-Gly。自动诱导培养基的配方如下:每升培养基中含有以下重量的各组分:胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，甘油5克，葡萄糖0.5克，乳糖2克，磷酸氢二钠7.1克，磷酸二氢钾6.8克，硫酸铵3.3克，硫酸钠0.9克，七水硫酸镁0.25go
[0033]将获得的重组蛋白Fn3-Gly_loop通过Western Blot方法测定糖基化效率。取0.50D菌用裂解液加热裂解，SDS-PAGE电泳后湿转至PVDF膜上，经过封闭后，加入一抗(I: 3000)进行室温孵育。二抗为辣根酶标记羊抗小鼠IgG(l: 4000)孵育清洗后，进行ECL发光检测，如图5所示。
[0034]4.超声破碎大量自动诱导培养(方法同前，试剂按比例扩大)收集的菌体制备可溶蛋白，超声破碎参数为功率300W，间隔时间10S，破碎时间10S，总时间20min。16000转/分钟离心20min后取上清，然后用镍柱纯化带有His-Tag标签的重组蛋白Fn3-Gly_loop。
[0035]本发明实施方式不限此，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和通用方法，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，本发明还可以有其它的实施方式。如可以用其它的大肠杆菌胞内表达载体等表达该类型的重组蛋白。因此，本发明还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，均落在本发明权利保护范围之内。
【主权项】
1.一种利用骨架蛋白Fn3在大肠杆菌体内建立N-糖基化效率检测受体蛋白模型的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)、Fn3突变体Fn3-Gly-loop重组蛋白基因表达载体构建: 1)根据Fn3骨架蛋白晶体结构，用PyMOL软件进行蛋白质模建设计糖基化位置，分别在Fn3蛋白loop区通过编码柔链GGGGS引入编码糖基化位点序列DQNAT，再通过编码柔链GGGGS引入编码6个组氨酸残基碱基序列； 2)根据大肠杆菌密码子偏好性，合成Fn3-Gly-loop基因，并克隆到pIG6H质周腔表达载体上，形成携带Fn3-Gly-loop基因的表达载体，命名为pIG6H-Fn3-Gly-l00p ; 3)将以上融合基因Fn3-Gly构建到大肠杆菌质周腔表达载体pIG6H上，与携带来源空肠弯曲菌的N-糖基化基因簇载体的pACYCpgl载体，在大肠杆菌质周腔内共同表达，该载体携带的基因簇可合成寡糖，并将寡糖N-糖基化在周质间腔表达的携带糖基化识别序列的重组蛋白，其寡糖分子组成为GalNAc- a I, 4-GalNAc - α 1，4_ (Glc - β 1，3_)GalNAc-α I, 4-GalNAc - α I, 4-GalNAc-α I, 3-Bac-β I ； (2)、将构建的重组蛋白基因表达载体及携带糖基化基因簇载体pACYCpgl用电击法共同转化到大肠杆菌工程菌株CLM37，经抗生素筛选得到阳性克隆，此阳性克隆表达的重组蛋白就含有将被重组糖基修饰的Fn3-Gly-loop蛋白，具体步骤为: 将构建的表达载体及pACYCpgl电击转化CLM37大肠杆菌菌株，然后将转化子接种到含有100微克每_升的氨节青霉和37微克每_升的氯霉素的LB固体培养基平板上，每升LB固体培养基中含胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化钠10克和15克琼脂粉，过夜24小时培养，筛选出单克隆后将其接种到含有100微克每毫升的氨苄青霉素和37微克每毫升的氯霉素的LB液体培养基，过夜16小时培养； 以1:100接种到10 _升含有100微克每_升的氨节青霉素和37微克每_升的氯霉素的LB液体培养基的三角瓶中，200rpm、37°C培养，直至OD6。。达到0.6 ;以1:100接种到100晕升含有100微克每晕升的氨节青霉素和37微克每_升的氯霉素的自动诱导培养基中，在25-35°C、200rpm条件诱导表达24小时，在此过程，在大肠杆菌胞内表达重组蛋白Fn3-Gly，自动诱导培养基的配方为:每升培养基中含有以下重量的各组分:胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，甘油5克，葡萄糖0.5克，乳糖2克，磷酸氢二钠7.1克，磷酸二氢钾6.8克，硫酸铵3.3克，硫酸钠0.9克，七水硫酸镁0.25g ； (3)、收集菌体裂解后WesternBlot法检测Fn3-Gly-l00p融合蛋白糖基化效率。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，涉及一种重组表达、分离纯化人源Fn3蛋白突变体作为N-糖基化效率检测模式蛋白的应用方法。该方法包括以下步骤：Fn3突变体Fn3-Gly-loop重组蛋白基因表达载体构建、将构建的表达载体用电击法共同转化到大肠杆菌工程菌株CLM37，经抗生素筛选得到阳性克隆，此重组蛋白就含有将被重组糖基修饰的Fn3-Gly-loop蛋白、Western？Blot法检测Fn3-Gly-loop融合蛋白糖基化效率。本发明在大肠杆菌体内用骨架蛋白Fn3作为受体蛋白，建立适合进行N-糖基化修饰效率研究的模式受体蛋白，可以解决在大肠杆菌体内简单、快速、高效地检测重组蛋白糖基化效率的问题。
【IPC分类】C12R1/19, C12N1/21, C07K19/00, C12N15/70
【公开号】CN105154461
【申请号】CN201510527816
【发明人】胡学军, 丁宁, 马君燕, 孙慎侠, 杨春光, 李梦阳, 张嘉宁
【申请人】大连大学
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年8月25日