胞单层上冲洗掉，然后加入 25mL指定的生长培养基，该培养基含有5%PBS，含有或不含F127,培养14天。每天取等分 试样，并在Vero细胞单层上测滴度。测量的病毒滴度如图2所示。
[0067] 实施例2
[006引在另一个示例性方法中，检测了在吸附和生长期间含有不断增加量的F127的Vero细胞中的DEN2/4 (登革热2/4)嵌合病毒的生长（参见例如图3)。在T75cm2烧瓶中， 在25mL含10%PBS和对照或不断增加浓度的F127的DMEM培养基中培养Vero细胞的汇合 单层。在该实验中使用的示例性F127浓度包括0. 063%、0. 125%、0. 25%、0. 5%、1. 0%和 2. 0%F127。用DEN2/4在MOI= 0.OOl时感染细胞。参数包括在1血DMEM/F127中吸附 1.5小时。每两天取等分试样，并在Vero细胞单层上进行滴定。测量的病毒滴度如图3中 所示。
[0069] 此外，另一个实验分析了嵌合黄病毒DEN2/1的病毒吸附期间共聚物F127的效果。 在该实施例中，DEN2/1W0.OOl的MOI吸附到Vero细胞的汇合烧瓶上90分钟。吸附是在 ImL含有或不含1%F127的生长培养基度A-1)中进行的。在病毒吸附后，向培养物中加入 20mL含2%FBS，不含F127的DMEM。每两天取等分试样，并在Vero细胞单层上进行滴定。 测定的病毒滴度如图4中所示。
[0070] 实施例3
[0071]另一个示例性方法分析了示例性共聚物F127存在时隧菌斑大小是否增加。 图5表示一个示例性表格一一表1。该实验证明生长期间存在不断增加浓度的聚氧两 婦濡霸两婦 9'F127 (泊洛沙姆407)时，黄病毒隧菌斑大小增加。在此，在T75cm2烧瓶中， 在20mL含有或不含F127的DMEM2%FBS培养基中培养Vero细胞的汇合单层，其中将Vero 细胞用DEN2/4在MOI= 0.OOl时感染。吸附1. 5小时，是在1血存在（0. 1 %或1. 0% )或 不存在F127的DMEM中进行的。将隧菌斑（例如8)在光盒上可视化，并测量其直径。表1 显示了在不存在F127或存在不断增加浓度的F127时，DENVax2/4生长隧菌斑大小（mm)差 异的单因素方差分析（onewayAN0VA)的结果。
[0072] 材料与方法：
[0073] 考虑本领域已知的任意方法可用于本文描述的任意组合物、方法和/或用途。在 某些实施方式中，考虑某些方法会比其他方法更适于病毒生长，例如用于黄病毒生长的材 料和方法。在其他实施方式中，考虑某些方法对登革热病毒的生长将比对其他黄病毒更合 适。下文提供关于在存在F127时培养高滴度嵌合登革热疫苗或任意活减毒黄病毒的方法 的简要说明。例如，使用T-75cm2烧瓶，在病毒感染/吸附2天之前W每个烧瓶5 X 10~6个 细胞的密度接种Vero细胞。该病毒生长可W"按比例增加"W包括从T-25cm2到10套细 胞工厂的组织培养容器。在细胞接种2天后，将病毒在ImL含F127 (0. 1% )的DMEM中吸附 到Vero细胞的汇合单层上。将该培养容器在37°C溫育1. 5小时，每10分钟摇动容器。在 病毒吸附后，用10血PBS冲洗细胞单层3次。然后将生长培养基（10血DMEM，PH= 7. 2， 含有3. 7g/L NaHC〇3和0. 1%F127,不含FB巧加入到该单层，并在通风或不通风的条件下在 37°C溫育4天。在病毒生长的第4天，如病毒吸附后所做的，更换生长培养基。从第6天开 始，直到第12天，将感染培养基从培养室中完全移除，并离屯、澄清。将该病毒培养物稳定并 储存在-80°C，直到其滴度能通过在Vero细胞单层上的隧菌斑分析而测定。在每天的收获 后，如第4天所做的，更换组织培养容器上的生长培养基。每天的收获持续到第12天。每 天的收获物分别在Vero细胞上滴定，可W将高滴度的收获物混合W获得均匀样品。通常， 不包括第一天的收获物（第6天），W避免高水平的宿主细胞（Vero) DNA。
[0074] 表1.DMEM-F12的例子：F-12营养混合物胞m)、含有心谷氨酷胺的粉末（21700)。 每IOL的添加物：11. 76g碳酸氨钢、100mL青霉素链霉素，调整将抑调到7. 2
[0076] 其他化合物：
[0077]
[00引]维生素：
[0085] 本文公开和要求保护的全部组合物和方法可W根据本公开内容制备和实施，不需 要过多的实验。虽然该组合物和方法W优选的实施方式描述，但是对本领域技术人员明显 的是在不背离本文的构思、精神和范围的条件下，可W对组合物和方法，W及本文所述方法 的步骤或步骤的顺序实施改变。更具体地，某些化学上和生理学上相关的药剂可代替本文 所述的药剂，而将获得相同或相似的结果。对本领域技术人员明显的所有运样相似的替换 和修改都被视为在如所附权利要求所限定的精神、范围和构思内。
【主权项】
1. 用于培养病毒培养物的组合物，其包括： 一种或多种高分子量表面活性剂或共聚物；以及 任选地，培养基， 其中所述高分子量表面活性剂或共聚物加速病毒培养物的生长。2. 权利要求1所述的组合物，其中所述高分子量表面活性剂或共聚物包含聚氧丙烯 F127、聚氧丙烯F68、聚氧丙烯P85、聚氧丙烯P123、其他分子量大于3000-4000的EO-PO嵌 段共聚物或其组合。3. 权利要求1所述的组合物，其中所述病毒培养物选自黄病毒、披膜病毒、冠状病毒、 弹状病毒、线状病毒、副粘病毒、正粘病毒、布尼亚病毒、沙粒病毒、逆转录病毒、嗜肝DNA病 毒、鼠疫病毒、小RNA病毒、萼状病毒、呼肠病毒、细小病毒、乳多空病毒、腺病毒、疱疹病毒 和痘病毒。4. 权利要求1所述的组合物，其中所述高分子量表面活性剂包含EO-PO嵌段共聚物聚 氧丙烯F127、聚氧丙烯P123或其组合。5. 权利要求1所述的组合物，其中至少一种所述高分子量表面活性剂包含聚氧丙烯 F127,所述培养基包含Dulbecco'sModifiedEagleMedium(DMEM)。6. 增加病毒生长速度的方法，包括给予用病毒感染的宿主细胞培养物包含一种或多种 高分子量表面活性剂或共聚物的组合物，其中所述组合物增加病毒生长速度。7. 增加病毒生长速度的方法，包括在病毒感染宿主细胞培养物之前、期间或之给予所 述宿主细胞培养物包含一种或多种高分子量表面活性剂或共聚物的组合物。8. 增加病毒培养物噬菌斑大小的方法，包括给予用病毒感染的宿主细胞培养物包含一 种或多种高分子量表面活性剂或共聚物的组合物，其中与没有给予一种或多种高分子量表 面活性剂或共聚物的对照病毒培养物相比，所述组合物增加病毒噬菌斑大小。9. 减少病毒培养物生长滞后时间的方法，包括给予用病毒感染的宿主细胞培养物包 含一种或多种高分子量表面活性剂或共聚物的组合物，其中与没有给予一种或多种高分子 量表面活性剂或共聚物的对照病毒培养物相比，所述组合物减少所述病毒培养物的滞后时 间。10. 用于培养病毒的试剂盒，包括： 至少一个容器； 包含一种或多种高分子量表面活性剂的组合物；和 任选地，一种或多种病毒培养物。
【专利摘要】本文的实施方式报道用于诱导和/或加速病毒生长的方法、组合物和用途。在某些实施方式中，方法、组合物和用途总体上涉及用于诱导病毒生长、减少滞后时间和/或增加病毒噬菌斑大小的共聚物组合物。在其他实施方式中，共聚物组合物的方法、组合物和用途能用于诱导黄病毒生长，减少生长滞后和/或增加噬菌斑大小。
【IPC分类】C12N7/00
【公开号】CN105219734
【申请号】CN201510470646
【发明人】D·T·斯廷什科姆, J·A·莱文古德, O`N·维根, R·金尼, J·奥索里奥
【申请人】武田疫苗公司
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2009年12月4日
【公告号】CA2745962A1, CN102272294A, CN102272294B, EP2366024A1, EP2366024A4, US8871487, US20100144015, US20150010983, WO2010065911A1