。
[00川表2检测ERCCl-202的巧光定量PCR反应体系
[0042]
[004引本实施例中用到的ERCCl-202引物对的上游引物序列为5' -GGCAMATCCMCAGCATCAT-3'， 下游引物序列为 5' -GCTCGTGCAGGACATCAAACA-3' ；ERCCl-202 探针为 5' -FAM-CAAATGTGGTCA GGAGGGTCT-MGB-3' ；
[0044] 分别W上述10倍稀释的含有四种邸CCl亚型的质粒为模版，结果如图1所示只有 当模版为202亚型质粒时PCR才能正常扩增，其余S组均不扩增。本结果证实了本发明对 ERCC1-202特异性高，与其他S种亚型无非特异性结合。
[0045] 实施例2验证本方法不受其他亚型干扰
[0046] 使用实施例1中的方法得到的ERCC1-202质粒，给予10倍稀释，使其浓度依次 为1〇6拷贝/yUlO5拷贝/yUlO4拷贝/yUiO3拷贝/化、10 2拷贝/化。另外取少量 祀GFP-C1-ERCC1-201 质粒、pEGFP-Cl-ERCCl-203 质粒、pEGFP-Cl-ERCCl-204 质粒分别稀释 到IO5拷贝/化。按照表2的反应体系上样。
[0047]PCR程序：95°C2min;95°C30sec，56°C50sec，40 个循环。
[004引本实施例中用到的ERCCl-202引物对的上游引物序列为5' -GGCAAMTOCMCAGCATCAT-3'， 下游引物序列为 5' -GCTCGTGCAGGACATCAAACA-3' ；ERCCl-202 探针为 5' -FAM-CAAATGTGGTCA GGAGGGTCT-MGB-3' ；反应体系中的模板分别为祀GFP-Cl-ERCCl-202+d地20、祀GFP-C1-ERCC 1-202+pEGFP-C1-ERCC1-201、pEGFP-C1-ERCC1-202+pEGFP-C1-ERCC1-203、pEGFP-C1-ERCC1 -202+PEGFP-C1-ERCC1-204。
[0049] 结果显示只有加入各组之间扩增无明显差异。本结果证实了本发明对ERCCl-202 特异性高，不受其他=种亚型的干扰。
[0050] 实施例3检测肺癌细胞的ERCCl-202表达量
[0051] 1.细胞培养：检测样品分别为人非小细胞肺癌细胞株A549细胞（细胞来自美国 菌种保藏中屯、）的CDNA及耐顺销的A549细胞（即A549/孤巧的cDNA。每天观看细胞生长 状况，若培养基颜色变黄，做如下处理：吸去旧培养基用3mL左右的PBS冲洗细胞一次，轻轻 摇晃后吸掉PBS，吸取1640培养基5血于T25瓶中，轻轻摇匀，继续培养于37°C，5%C〇2培 养箱中（一般I~2天更换一次培养液）；观察细胞生长状况，若细胞长满90%~100%， 做如下处理：吸去旧培养基，用3mL左右PBS冲洗培养瓶中，轻轻摇晃后吸掉PBS，加入ImL 膜酶，放入37°C，5% %培养箱中消化2~3min，待细胞变圆，触角消失，镜下观察后，稍用 力敲击瓶皿，使细胞脱落。吸取ImL1640培养基（含胎牛血清）终止消化，并吹打，吹散细 胞，将所有细胞悬液于离屯、管中，封口后放入离屯、机中，12(K)巧m/3min离屯、结束后弃上清， 最后在上述细胞沉淀中加入1血RNALater,并重悬，于-80°C保存。
[0052] 2.提取总RNA:使用Trizol法分别提取A549/DDP及A549细胞总RNA。通过核酸 蛋白测定仪测定260nm和280nm处光密度值计算RNA的纯度和浓度。
[0053] 3.反转录PCR :统一总RNA起始量为2 y g，通过计算得出每个样本反转录所需RNA 的加样量并按照如下反应体系加样。
[0054] !"akaRa PrimeScript RT Enzyme Mix I 0. 5 Ji L [00巧]SXPrimeScript BuffeHfor real time) 2. 0 JiL
[0056] Oligo dT Primer (50 y M) 0. 5 y L
[0057] Random 6mers (100 y M) 2 y L
[0058] Total RNA
[0059] foiase Rree地2〇补充体系至10 y L。
[0060] 表3检测ERCCl-202的巧光定量PCR反应体系
[0062]本实施例中用到的ERCC1-202引物对的上游引物序列为5' -GGCAMAT0CMCAGCATCAT-3'， 下游引物序列为5' -GCTCGTGCAGGACATCAAACA-3' ； 0 -Actin的上游引物核巧酸序列为 5' -ATCCTCACCCTGAAGTACCC-3'，下游引物核巧酸序列为 5' -ACGCAGCTCATTGTAGAAGG-3' ；ERCC1-202 探针为 5' -FAM-CAAATGTGGTCAGGAGGGTCT-MGB-3' ；所述 0-Actin探针为 5'-TET -CAGATTTTCTCCATGTCGTCCCA-MGB-3'。同时使用实施例1中的方法10倍稀释ERCC1-202和 0 -Actin的标准质粒，作为PCR反应的模版。
[0063]PCR反应体系如表 3 所示，PCR程序：95°C2min;95°C30sec，56°C50sec，40 个循 环。采用巧光定量PCR仪自带的巧光信号分析软件分析样品，进行2批次试验，每批设S个 复孔。结果如表4所示。
[0064] 表4各批次A549细胞及A549/DDP细胞的Real-timePCR结果
[0067] 从表中可W看出，对顺销耐药的A549细胞的ERCC1-202表达量较不耐药组明显升 高，重复试验的基因拷贝数相对标准偏差为7. 4%~12. 1%，说明本方法具有重复性好、结 果稳定等优点。
【主权项】
1. 一种定量检测ERCC1-202的试剂盒，其特征在于包括： ERCC1-202 上游引物 5'-GGCAAAATCCAACAGCATCAT-3' ； ERCC1-202 下游引物 5'-GCTCGTGCAGGACATCAAACA-3' ； P-Actin 内参的上游引物 5'- ATCCTCACCCTGAAGTACCC -3' ； P-Actin 内参的下游引物 5'- ACGCAGCTCAITGTAGAAGG -3' ； ERCC1-202 探针 5' -F-CAAATGTGGTCAGGAGGGTCT-Q-3' ； 0 -Actin 探针 5' -F- CAGATTTTCTCCATGTCGTCCCA -Q-3' ； 其中F为报告荧光基团，Q为淬灭荧光基团。2. 根据权利要求1所述定量检测ERCC1-202的试剂盒，其特征在于所述报告荧光基团 为FAM、TAMRA、JOE、HEX或TET;所述淬灭荧光基团为BHQ或MGB。3. 权利要求1所述定量检测ERCC1-202的试剂盒的应用，其特征在于利用引物和探针 分别对标准品及待检检测样品进行荧光定量PCR扩增，扩增过程中收集荧光信号，PCR扩 增体系包括Taq酶、Buffer、dNTP、ERCC1-202 上下游引物、ERCC1-202 探针、P-Actin上 下游引物、P-Actin探针、cDNA模版以及双蒸水；PCR扩增程序是95°C2min;95°C30sec， 56°C50sec，循环 40 次。4. 根据权利要求3所述定量检测ERCC1-202的试剂盒的应用，其特征在于PCR检测的 标准品包括含有ERCC1-202质粒标准品和含有-Actin基因的质粒标准品；待检检测样品 为从肿瘤组织中抽提的总RNA经反转录获得的cDNA。5. 根据权利要求4所述定量检测ERCC1-202的试剂盒的应用，其特征在于待检检测样 品来源包括新鲜手术病理切片、肺部穿刺活检标本、内镜活检标本、胸水脱落细胞、腹水脱 落细胞或体外培养细胞。
【专利摘要】一种定量检测ERCC1-202的试剂盒及应用，包括ERCC1-202上下游引物、β-Actin内参的上下游引物、ERCC1-202探针和β-Actin探针。本发明通过构建ERCC1-202与内参β-Actin基因的标准质粒，分别按照标准曲线法对ERCC1-202及β-Actin进行绝对定量，进而实现ERCC1-202相对定量，可为肿瘤病人用药提供参考依据。本发明可以特异性检测ERCC1基因的202亚型mRNA的表达量，不受其他亚型干扰，具有特异性强、敏感性高、结果稳定等优点。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105219881
【申请号】CN201510791147
【发明人】吴国球, 王西勇
【申请人】东南大学
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年11月17日