光强度。
[0287] 实验结果
[0288] 测试结果示于图1。化合物：Adva_27afh=实施例1 ;Adva_27af=实施例2。
[0289] (3)有BSA存在下的人拓扑异构酶IIDNA解连接测试
[0290] 负对照是含20mMEDTA的试验。正对照是不含抑制剂的试验。化合物的荧光背景 用含DNA和荧光染料的相同化合物浓度来测量。
[0291] 利用人topoIIDNA解连接测试试剂盒，96-孔人拓扑异构酶IIDNA解连接测试 试剂盒+ (来自MoBiTecl，目录编号HDD96KE)检测抑制作用。
[0292] 各反应混合物的总体积是50μL。在V底部测试平板中，1μL抑制剂和24μL预混 合物混合。反应用25yL20mMMgCl2启动。通过在含有0. 5mg/mlBSA的酶稀释缓冲液中 混合810 4 1氏0、300 4 1^1(^测试缓冲液、30(^1^2(^8/1111浓度的0嫩、3(^1^1001111八丁？ 和30yL500U/ml人拓扑异构酶ΙΙα酶（topoII)来制备预混合物。反应混合物在室温 下培育40分钟。然后向其加入0. 2MEDTA(5yL)以停止反应。
[0293] 人topoII试验的终浓度是50mMTris-HCL、pH8. 0,125mMNaCI，0. 5mMEDTA，10mM MgCl2、2μg/ml浓度的DNA、ImMATP、5U/ml人topoIIα酶和 5μg/mlBSA。
[0294] 将样本（50μL)加载于真空歧管上的TDD过滤平板中。然后施加真空（80kPa或者 600mmHg)直至溶液通过过滤器。滤液用150yL清洗缓冲液（10mMTris-HCL、pH7.5、10mM NaCI)清洗。最终向其中添加IX荧光染料（50μL)，使用485nm激发波长检测535nm的荧 光强度。
[0295] 实验结果
[0296] 测试结果示于图2。化合物：Adva_27afh=实施例1 ;Adva_27af=实施例2。
[0297] 3. 2-在多药抗性的人乳腺癌细胞系（MCF7/mdr)中体外评估时间依赖性生长抑制 活性
[0298] ⑴细胞培养
[0299] 从捐献者获得多药抗性的人乳腺癌细胞系（MCF7/mdr)。在37°C，0)2培养箱中，利 用含10%FBS的RPMI1640培养基培养MCF7/mdr细胞，其中向培养基添加谷氨酰胺（2mM)、 青霉素（1001.U.)和链霉素（100μg/ml)和HEPES(10mM)。细胞解冻且保存在0. 8μΜ阿霉 素中（来自Sig_-Aldrich?加拿大，目录号D1515) -周，然后进行研究。在研究期间，培 养基不含阿霉素。
[0300] (2)生长抑制分析
[0301] 在第1天，将MCF-7/mdr细胞以~18000细胞/孔接种在12孔组织培养平板上。 涂板后24小时（D0)，用0. 4%DMS0或3、6、9、12、24μΜ的测试品（实施例1、实施例2和依 托泊苷）处理细胞。对于用测试品处理的所有孔，最终DMS0浓度是0.4%。
[0302] 在处理后0(第0天）、24(第1天）、48(第2天）、72(第3天）、96(第4天）和 120(第5天）小时，回收一个平板，终止研究以供时程分析。培养基轻轻吸出，细胞用2ml 无菌PBS清洗一次。胰蛋白酶-0. 25%EDTA(0. 4ml)用于从平板上分离细胞，添加lml培养 基去使胰蛋白酶灭活。细胞转移到1. 5mlEppendorRSH式管，在2500rpm旋转2分钟收集细 胞沉淀。细胞沉淀重悬在50μ1PBS中。细胞（20μ1)用0. 4%台酚蓝染色溶液（20μ1) 以供血细胞计数器进行细胞计数。
[0303] (3)结果
[0304] 显示用或不用不同化合物处理的MCF-7/mdr癌细胞的时间依赖性生长的结果示 于图3A-D。化合物：Adva_27afh=实施例1。Adva_27af=实施例2。
[0305] 3. 3-在多药抗性的人肺癌细胞系（H69AR)中体外评估时间依赖性生长抑制活性
[0306] ⑴细胞培养
[0307] 多药抗性的人肺癌细胞系（H69AR)从美洲组织培养保藏中心（American TissueCulture Collection) via-Cedgtflaiie·1 (伯灵顿，安大略省，加拿大）购买。在 37°C，0)2培养箱中，利用含20%FBS的RPMI1640培养基培养H69AR细胞，其中向培养基 添加谷氨酰胺（2mM)、青霉素（1001.U.)和链霉素（100μg/ml)和HEPES(lOmM)。细胞解冻 且保存在浓度渐增的〇. 1-0. 5μΜ阿霉素中（来自Sigma-Aldrich?加拿大，目录号D1515) 约一周，然后进行研究。在研究期间，培养基不含阿霉素。
[0308] 在37°CC02中培育，在带有20%FBS的RPMI1640培养基里，向培养基里添加谷氨 酰胺（2mM)、青霉素（100I.U.)和链霉素（100g/ml)和HEPES(lOmM)。在研究之前，细胞解 冻且保存在0. 8M阿霉素里（来自Sigma-Aldrich?Canada，编号D1515) -周。在研究期间， 在培养基中没有阿霉素。
[0309] (2)生长抑制分析
[0310] 在第1天，将H69AR细胞以~50000细胞/孔接种在12孔组织培养平板上。涂板 后24小时（D0)，用0.4%DMS0或3、6、9、12、24μΜ的测试品（实施例1和依托泊苷）处理 细胞。对于用测试品处理的所有孔，最终DMS0浓度是0. 4%。
[0311] 在处理后0(第0天）、24(第1天）、48(第2天）、72(第3天）、96(第4天）和 120(第5天）小时，回收一个平板，终止研究以供时程分析。培养基轻轻吸出，细胞用2ml 无菌PBS清洗一次。胰蛋白酶-0. 25%EDTA(0. 4ml)用于从平板上分离细胞，添加lml培养 基去使胰蛋白酶灭活。细胞转移到1. 5mlBppendor麗?试管，在2500rpm旋转2分钟收集细 胞沉淀。细胞沉淀重悬在50μ1PBS中。细胞（20μ1)用0. 4%台酚蓝染色溶液（20μ1) 以供血细胞计数器进行细胞计数。
[0312] ⑶结果
[0313] 显示用或不用不同化合物处理的H69AR癌细胞的时间依赖性生长的结果示于图 4A-C。Adva_27afh=实施例 1。
[0314] 3.4在多药抗性的人子宫肉瘤癌细胞系（1^5-5六/1?5)中体外评估时间依赖性生 长抑制活性
[0315] ⑴细胞培养
[0316] 多药抗性的人子宫肉瘤细胞系（MES-SA/DX5)从美洲组织培养保藏中心 (AmericanTissueCultureCollection) \ia?Cedarlane? (伯灵顿，安大略省，加拿大） (目录号CRL-1977)购买。在37°(：，0)2培养箱中，利用含10%FBS的McCoy5A培养基培养 MES-SA/DX5细胞，其中向培养基添加谷氨酰胺（2mM)、青霉素（1001.U.)和链霉素（100μg/ ml) 〇
[0317] (2)生长抑制分析
[0318] 在第1天，将MES-SA/Dx5细胞以~300000细胞/孔接种在12孔组织培养平板上。 涂板后24小时（D0)，用0· 4%DMS0或3、6、9、12、24μΜ的测试品（实施例1和依托泊苷） 处理细胞。对于用测试品处理的所有孔，最终DMS0浓度是0. 4%。
[0319] 在处理后0(第0天）、24(第1天）、48(第2天）、72(第3天）、96(第4天）和 120(第5天）小时，回收一个平板，终止研究以供时程分析。培养基轻轻吸出，细胞用2ml 无菌PBS清洗一次。胰蛋白酶-0. 25%EDTA(0. 4ml)用于从平板上分离细胞，添加lml培养 基去使胰蛋白酶灭活。细胞转移到1. 5mlBppendori·试管，在2500rpm旋转2分钟收集细 胞沉淀。细胞沉淀重悬在50μ1PBS中。细胞（20μ1)用0. 4%台酚蓝染色溶液（20μ1) 以供血细胞计数器进行细胞计数。
[0320] (3)结果
[0321] 显示用或不用不同化合物处理的MES_SA/Dx5癌细胞的时间依赖性生长的结果示 于图5A-C。化合物：Adva-27afh=实施例1。
[0322] 虽然上述描述了并在附图中显示了优选的实施方式，然而在不背离本发明的情况 下，一些修改对本领域人员是显而易见的。该修改认为是包含于本发明范围内可能的改变 形式。
【主权项】
1. 一种式I所示化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物：其中： R是氨原子或选自W下的基团：直链或支链烷基、苄基、乙酷基或苯甲酯基， Ri和R2相同或不同，它们是氨原子或选自W下的径基保护基团：直链或支链烷基、节 基、苯甲酯基、乙酷基或新戊酷基，或CR'R"型的缩醒基团，其中R'和R"相同或不同，它们 是氨原子或选自W下的基团：直链或支链烷基、芳基或烷基-芳基， R3是氨原子或选自W下的基团：直链或支链烷基、苄基、苯甲酯基、乙酷基或新戊酷基，R4代表OR"'、NGR'GR"、N3或邻苯二甲酯亚胺，其中R"'是氨原子或选自W下的径基保 护基团：直链或支链烷基、苄基、苯甲酯基、乙酷基或新戊酷基，GR'和GR"相同或不同，它们 是氨原子或选自W下的基团：直链或支链烷基、苄基、苯甲酯基、乙酷基、烷氧基幾基、締丙 基氧基幾基或节氧基幾基， R5是氨原子或选自W下的基团：直链或支链烷基、乙酷基、苄基、P0 3H或P〇3化基团。2. -种式II所示化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物：式中： R4、R5如权利要求1中定义， R6是氨原子或选自W下的基团：烷基、芳基、烷基-芳基、杂芳基或烷基-杂芳基。3. -种式III所示化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物：式中： R5是氨原子或选自W下的基团：烷基、-P0sH或-P〇3化。4. 如权利要求3所述的化合物，其特征在于，所述化合物是： 巧R, 5aR, 8aS, 9S) -9- ((2, 2-二氣-2- ((2R, 3R, 4S, 5S, 6R) -3, 4, 5-Ξ径基-6-(径甲 基）四氨-2H-化喃-2-基）乙基）氨基）-5-(4-径基-3,5-二甲氧基苯基）-5,5曰，8曰，9-四 氨巧喃并巧'，4' : 6, 7]糞并巧，3-d] [1，3]二氧杂环戊二締-6 (8H)-酬。5. 如权利要求3所述的化合物，其特征在于，所述化合物是： 巧R, 5aR, 8aS, 9S) -9- ((2, 2-二氣-2- ((2R, 3R, 4S, 5S, 6R) -3, 4, 5-Ξ径基-6-(径甲 基）四氨-2H-化喃-2-基）乙基）氨基）-5-化4,5-Ξ甲氧基苯基）-5,5a，8a，9-四氨巧 喃并巧'，4' : 6, 7]糞并巧，3-d] [1，3]二氧杂环戊二締-6 (8H)-酬。6. -种制备权利要求1-5中任一项所述化合物的方法，包括在式IV所示化合物与式V 所示化合物或式VI所示化合物之间的偶联步骤：其中R5如式I到III中定义，其中 Ri、R2、r3、R4如权利要求1中式I的定义， R是Ci-Ci2烷基，和 其中式IV所示化合物可W通过W下方式获得：鬼白毒素或脱甲基鬼白毒素的差向异 构化，然后用叠氮基取代4位的醇官能团，随后还原成胺基。7. 式（VII)或（VIII)所示化合物：其中R是选自下组的基团：甲基、乙基、下基或异丙基。8. 权利要求1-5中任一项所述的至少一种化合物在制备癌症治疗药物中的应用。9. 权利要求1-5中任一项所述的至少一种化合物在治疗癌症中的应用。10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用与放疗联用。11. 如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用可与一种或多种其它抗癌症药剂 联用。12. 如权利要求8-11中任一项所述的应用，其特征在于，所述癌症选自：膀脫癌、脑癌、 乳腺癌、子宫癌、慢性淋己细胞性白血病、结肠癌、食道癌、肝癌、睾丸素、成淋己细胞性白血 病、滤泡性淋己瘤、黑色素瘤、恶性血液疾病、骨髓瘤、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小 细胞肺癌、急性白血病、卡波西肉瘤和淋己恶性肿瘤。13. -种治疗罹患癌症的患者的方法，包括给予该患者治疗有效量的权利要求1-5中 任一项所述的化合物。14. 一种治疗罹患癌症的患者的方法，包括组合给予该患者治疗有效量的权利要求 1-5中任一项所述的化合物与放疗。15. -种治疗罹患癌症的患者的方法，包括组合给予该患者治疗有效量的权利要求 1-5中任一项所述的化合物与一种或多种其它抗癌剂。16. 如权利要求13-15中任一项所述的方法，其特征在于，所述癌症选自：膀脫癌、脑 癌、乳腺癌、子宫癌、慢性淋己细胞性白血病、结肠癌、食道癌、肝癌、睾丸素、成淋己细胞性 白血病、滤泡性淋己瘤、黑色素瘤、恶性血液疾病、骨髓瘤、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺 癌、小细胞肺癌、急性白血病、卡波西肉瘤和淋己恶性肿瘤。
【专利摘要】本发明描述了衍生自鬼臼毒素的一类新颖的gem-二氟化C-糖苷化合物的合成，所述化合物可在肿瘤学上用于治疗癌症，但不限于此。更具体地说，鬼臼毒素gem-二氟化C-糖基偶联衍生物表现出改善的构象和化学稳定性，对耐药癌症细胞系表现出改善的细胞毒性。
【IPC分类】A61P35/00, C07D309/10, C07D493/04, A61K31/365
【公开号】CN105246899
【申请号】CN201480015506
【发明人】S·N·斯利拉堤
【申请人】艾德瓦诺米科斯公司
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2014年1月13日
【公告号】CA2897768A1, EP2943497A1, US20150353573, WO2014107803A1