M盐酸精氨酸，PH6. 50-7. 50。
[0010] 5.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的 方法，其特征在于：步骤（6)所述的弱阴离子交换柱层析所用填料为DEAE-SepharoseFF或 CaptoDEAE;步骤（6)所述的平衡缓冲液3组成为0. 01M-0. 02M柠檬酸钠，0. 075M-0. 1M氯 化钠，PH6. 50-7. 50 ;所述的洗脱缓冲液3组成为0. 01M-0. 02M柠檬酸钠，0. 15M-0. 30M氯 化钠，0. 02-0. 04M盐酸精氨酸，PH6. 50-7. 50。
[0011] 6.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的 方法，其特征在于：步骤（7)所述的肝素亲和柱层析所用填料为HeparinSepharoseFF或 ifeparinS印haroseCL-6B;步骤（7)所述的平衡缓冲液4组成为0·01Μ-(λ02Μ柠檬酸钠， 0. 1Μ-0. 15Μ氯化钠溶液，ΡΗ6. 50-7. 50 ;所述的洗涤缓冲液4组成为0. 01Μ-0. 02Μ柠檬酸 钠，0. 15-0. 25Μ氯化钠溶液，ΡΗ6. 50-7. 50 ;所述的洗脱缓冲液4组成为0. 01Μ-0. 02Μ柠檬 酸钠，0. 02Μ盐酸精氨酸，0. 4Μ-1. 0Μ氯化钠溶液，ΡΗ6. 50-7. 50。
[0012] 7.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII 的方法，其特征在于：步骤（5)~(7)所述的稀释液组成为0.01Μ-0.02Μ柠檬酸钠， 0. 02-0. 04Μ盐酸精氨酸，ΡΗ6. 50-7. 50。
[0013] 8.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的 方法，其特征在于：步骤（8)所述的透析液组成为0. 01Μ柠檬酸钠，0. 075Μ-0. 125Μ氯 化钠，ΡΗ6. 50-7. 50 ;该透析液对FVII及FIX均适合。
[0014] 9.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的 方法，其特征在于：步骤（9)所述的稳定剂，对于FVIII而言，稳定剂是精氨酸盐酸盐与甘氨 酸，其中精氨酸盐酸盐加至〇. 5-3%，甘氨酸加至0. 5-3% ;对于FIX而言，稳定剂是组氨酸与 甘氨酸，其中组氨酸加至〇. 5-3%，甘氨酸加至0. 5-3%。
[0015] 10.根据权利要求1-9所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII 的方法，其特征在于：FVII冻干制剂与FIX冻干制剂均经历了S/D病毒灭活、纳米膜除病毒 过滤及干热病毒灭活三个步骤。
[0016] 本发明的优越性 1，本发明采用离子交换填料及肝素亲和填料从血浆中同时制备高纯人凝血FVII及凝 血FIX，流程简洁，技术成熟，血浆利用率高； 2, 采用PEG沉淀去除杂蛋白，大大减轻了后续柱层析的纯化压力，提高了终产品的比 活； 3, PEG的引入，在S/D过程中起蛋白保护作用，防止蛋白变性及凝血因子失活； 4, 在柱层析操作中，在洗脱缓冲液中均加入了蛋白保护剂，大大降低了制品被激活的 概率； 5, 本发明的生产流程中共使用了S/D病毒灭活、20纳米膜过滤去病毒及干热病毒灭活 病三重灭除病毒措施，对脂包膜病毒、非脂包膜病毒及细小病毒进行了有效灭除，大大提高 了产品的使用安全性。
【附图说明】
[0017] 图1是从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的工艺流程图。
【具体实施方式】 下面结合附图及实施例对本发明做进一步的说明，不能认为本发明的实施方式仅限于 此，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下所做出 的若干简单的改变或替换，都应视为属于本发明权利要求书确定的专利保护范围。
[0018] 实施例一 1，去冷胶血浆的制备：取冰冻血浆35袋，用70%乙醇消毒并用注射用水冲洗后割袋，在 夹套坦克中将冰冻血浆融化，称取20kg，在0-3°C下连续离心，去除冷胶，收集上清，后用颇 尔公司生产的Supradur50P滤板串联0. 45Mm滤芯过滤，得到澄清的去冷胶血衆；过滤前， 用缓冲液（PH6. 90-7. 10，0. 02M柠檬酸钠，0. 1M氯化钠）预洗滤芯； 2,第一次强阴离子交换柱层析：将步骤1得到的澄清去冷胶血浆上QS印harose4FF柱，柱子预先用平衡缓冲液（PH6.90-7. 10，0.02M柠檬酸钠，0. 1M氯化钠，）平衡；上柱 结束后，用以上平衡缓冲液冲洗柱子，然后用洗脱缓冲液（PH6. 90-7. 10，0. 02M柠檬酸钠， 0. 8M氯化钠，0. 04M盐酸精氨酸）洗脱柱子，收集洗脱液； 3，PEG沉淀去杂蛋白：以上洗脱液中加入50%PEG溶液使最终PEG浓度至3%，搅拌1.5 小时，后用1.OMffl串联0. 45μπι滤芯过滤，得到澄清的滤液； 4, S/D病毒灭活：以上滤液中加入Tween80至1. 0%(wt%)，TNBP(磷酸三丁酯）至0. 3% (wt%)，搅勾后升温至24-26°C，后保温6小时； 5, 第二次强阴离子柱层析：将上述S/D后的溶液用稀释液（PH6. 90-7. 10，0. 02M柠 檬酸钠，〇. 04M盐酸精氨酸)稀释到电导率小于15ms/cm(25°C)，然后上QSepharose4FF 柱，柱子预先用平衡缓冲液（PH6. 90-7. 10，0.02M柠檬酸钠，0. 15M氯化钠，）平衡；上柱 结束后，用以上平衡缓冲液洗涤柱子，然后用洗脱缓冲液A(PH6. 90-7. 10，0. 02M柠檬酸 钠，0.25M氯化钠，0.04M盐酸精氨酸）洗脱柱子，收集洗脱液A(凝血七因子粗品）；再用 洗脱缓冲液B(PH6.90-7. 10，0.02M柠檬酸钠，0. 5M氯化钠，0.04M盐酸精氨酸)洗脱，收 集洗脱液B(凝血FIX粗品)，置于2-8°C; 6, 弱阴离子柱层析纯化凝血FVII:将上述洗脱液A用稀释液（PH6. 90-7. 10，0. 02M柠 檬酸钠，〇. 04M盐酸精氨酸）稀释到原来的2. 5倍，然后上DEAE-S印haroseFF柱，柱子预 先用平衡缓冲液（PH6.90-7. 10，0.02M柠檬酸钠，0. 1M氯化钠，）平衡；上柱结束后，用 以上平衡缓冲液洗涤柱子，然后用洗脱缓冲液（PH6.90-7. 10，0.02M柠檬酸钠，0. 2M氯化 钠，0. 04M盐酸精氨酸）洗脱柱子，得到精制的凝血七因子溶液；用0. 45μπι滤芯过滤得到澄 清滤液，置于2-8°C; 7, 肝素亲和柱层析纯化凝血FIX:将步骤5得到的洗脱液B用稀释液（PH6. 90-7. 10， 0· 02M柠檬酸钠，0· 04M盐酸精氨酸）稀释到电导率小于15ms/cm(25°C)，上！feparin S印harose6FF柱，柱子预先用平衡缓冲液平衡，平衡缓冲液为0.02M柠檬酸钠，0. 1M 氯化钠溶液，PH6. 90-7. 10)，后用洗涤缓冲液（0. 02M柠檬酸钠，0. 175M氯化钠溶液， PH6.90-7. 10)洗涤，再用洗脱缓冲液（0.02M柠檬酸钠，0.04M盐酸精氨酸，0. 5M氯化 钠溶液，PH6. 90-7. 10)洗脱，收集洗脱液，用0. 45Mm滤芯过滤以上洗脱液，得到精制的凝血 FIX溶液； 8, 用10k分子量的超滤膜包分别浓缩步骤6, 7得到的凝血FVII及FIX滤液，并用透 析液（0. 02M柠檬酸钠，0. 1M氯化钠溶液，PH6. 90-7. 10)分别透析，后浓缩至所需活力效 价后移出超滤膜包，分别得到凝血FVII及凝血FIX浓缩液205克，231克，活力分别为 39. 7IU/ml, 36. 4IU/ml; 9, 按照30IU/ml的规格分别调节人凝血FVII溶液及FIX溶液的活力，后分别调PH值 至6. 90-7. 10,在FVII溶液中加