血制品的加工生产；上柱结束 后，用平衡缓冲液1冲洗柱子，然后用洗脱缓冲液1洗脱柱子，收集洗脱液，即为富含FVII 与FIX的溶液； (3) PEG沉淀去杂蛋白 在步骤（2)收集的洗脱液中加入50%PEG溶液使最终PEG浓度至3-6%，搅拌0. 5-1. 5 小时，后用1. 〇Mm滤芯过滤，收集澄清的滤液； (4)S/D病毒灭活 在步骤（3)收集的滤液中加入Tween80至1. 0% (wt%)，TNBP(磷酸三丁酯）至0· 3% (wt%)，搅匀后升温至24-26°C，后保温6-7小时； (5) 第二次强阴离子柱层析 将上述S/D后的溶液用稀释液稀释到电导率小于15mS/cm(25°C)，然后上强阴离子柱， 柱子预先用平衡缓冲液2平衡；上柱结束后，用平衡缓冲液2冲洗柱子，然后用洗脱缓冲液 2A洗脱柱子，所得洗脱液A即为凝血FVII粗品；再用洗脱缓冲液2B洗脱，收集洗脱液B即 为凝血FIX粗品； (6) 弱阴离子柱层析纯化凝血FVII 将上述洗脱液A用稀释液稀释到原来的2-4倍，然后上弱阴离子柱，柱子预先用平衡缓 冲液3平衡；上柱结束后，用以上平衡缓冲液3冲洗柱子，然后用洗脱缓冲液3洗脱柱子，所 得洗脱液即为精制的凝血FVII溶液；用0. 45μπι滤芯过滤得到澄清滤液； (7) 肝素亲和柱层析纯化凝血FIX 将以上洗脱液B用稀释液稀释到电导率小于15mS/cm(25°C)，上肝素亲和柱，柱子预 先用平衡缓冲液4平衡，后用洗涤缓冲液4洗涤，再用洗脱缓冲液4洗脱，收集洗脱液，用 0. 45Pm滤芯过滤，所得滤液即为精制的凝血FIX溶液； (8) 超滤 用5K~10k截留分子量的超滤膜包分别浓缩以上FVII及FIX滤液，并用透析液分别恒 体积透析4-6倍，后浓缩至所需活力效价后移出超滤膜包； (9) 加稳定剂及调节 按照所需规格分别调节人凝血FVII的效价及FIX的效价至所需值(一般为20-30IU/ml)，后分别加入稳定剂并分别调PH值至6. 50-7. 50 ; (10) 纳米膜除病毒过滤 分别用15-20纳米滤芯对以上FVII及FIX溶液进行除病毒过滤； (11) 除菌过滤并分装 分别用0. 22Mm滤芯对以上FVII及FIX溶液进行 (12) 冻干 分别冻干以上凝血FVII及FIX原液，得到凝血FVII及FIX冻干粉； (13) 干热除病毒过滤 分别或同时将FVII及FIX冻干品在100°C沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活。2. 根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法， 其特征在于：步骤（2)所述的强阴离子交换柱层析所用填料为CaptoQ，QSepharoseFF, QSepharose4FFQSepharoseHP,QSepharoseXL中的任意一种。3. 根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法， 其特征在于：步骤（2)所述的柱层析所用的平衡缓冲液1组成为0. 01M-0. 02M柠檬酸钠， 0. 075M-0. 15M氯化钠，PH6. 50-7. 50 ;所述的洗脱缓冲液1组成为0. 01M-0. 02M柠檬酸钠， 0· 4M-0. 8M氯化钠，0· 02-0. 04M盐酸精氨酸，PH6. 50-7. 50。4. 根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法， 其特征在于：步骤（6)所述的强阴离子交换柱层析所用填料为CaptoQ，QSepharoseFF, QSepharose4FFQSepharoseHP,QSepharoseXL中的任意一种；步骤（5)所述的平衡 缓冲液2组成为0. 01M-0. 02M柠檬酸钠，0. 075M-0. 15M氯化钠，PH6. 50-7. 50 ;步骤（5)所 述的洗脱缓冲液2A组成为0. 01M-0. 02M柠檬酸钠，0. 175M-0. 35M氯化钠，0. 02-0. 04M盐 酸精氨酸，PH6. 50-7. 50 ;步骤（5)所述的洗脱缓冲液2B组成为0. 01M-0. 02M柠檬酸钠， 0· 5M-L0M氯化钠，(λ02-0. 04M盐酸精氨酸，PH6. 50-7. 50。5. 根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法， 其特征在于：步骤（6)所述的弱阴离子交换柱层析所用填料为DEAE-SepharoseFF或Capto DEAE;步骤（6)所述的平衡缓冲液3组成为0. 01M-0. 02M柠檬酸钠，0. 075M-0. 1M氯化钠， PH6. 50-7. 50 ;所述的洗脱缓冲液3组成为0. 01M-0. 02M柠檬酸钠，0. 15M-0. 30M氯化钠， 0. 02-0. 04M盐酸精氨酸，PH6. 50-7. 50。6. 根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方 法，其特征在于：步骤（7)所述的肝素亲和柱层析所用填料为HeparinSepharoseFF或 ifeparinS印haroseCL-6B;步骤（7)所述的平衡缓冲液4组成为0·01Μ-(λ02Μ柠檬酸钠， 0. 1Μ-0. 15Μ氯化钠溶液，ΡΗ6. 50-7. 50 ;所述的洗涤缓冲液4组成为0. 01Μ-0. 02Μ柠檬酸 钠，0. 15-0. 25Μ氯化钠溶液，ΡΗ6. 50-7. 50 ;所述的洗脱缓冲液4组成为0. 01Μ-0. 02Μ柠檬 酸钠，0. 02Μ盐酸精氨酸，0. 4Μ-1. 0Μ氯化钠溶液，ΡΗ6. 50-7. 50。7. 根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法， 其特征在于：步骤（5)~ (7)所述的稀释液组成为0. 01Μ-0. 02Μ柠檬酸钠，0. 02-0. 04Μ盐 酸精氨酸，ΡΗ6. 50-7. 50。8. 根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法， 其特征在于：步骤（8)所述的透析液组成为0. 01Μ柠檬酸钠，0. 075Μ-0. 125Μ氯化钠， ΡΗ6. 50-7. 50 ;该透析液对FVII及FIX均适合。9. 根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法， 其特征在于：步骤（9)所述的稳定剂，对于FVIII而言，稳定剂是精氨酸盐酸盐与甘氨酸，其 中精氨酸盐酸盐加至〇. 5-3%，甘氨酸加至0. 5-3% ;对于FIX而言，稳定剂是组氨酸与甘氨 酸，其中组氨酸加至0. 5-3%，甘氨酸加至0. 5-3%。10.根据权利要求1-9所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方 法，其特征在于：FVII冻干制剂与FIX冻干制剂均经历了S/D病毒灭活、纳米膜除病毒过滤 及干热病毒灭活三个步骤。
【专利摘要】本发明公开了一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，包括如下步骤：（1）血浆去冷胶；（2）第一次强阴离子交换柱层析；（3）PEG沉淀去杂蛋白；（4）S/D病毒灭活；（5）第二次强阴离子交换柱层析分别得到FVII洗脱液与FIX洗脱液；（6）弱阴离子交换柱层析纯化凝血FVII；（7）肝素亲和柱层析纯化凝血FIX；（8）超滤；（9）加稳定剂及调节；（10）纳米膜除病毒过滤；（11）除菌过滤并分装；（12）冻干；（13）干热病毒灭活。本发明采用PEG沉淀去杂蛋白，通过离子交换层析结合亲和层析纯化技术，实现了同时制备高纯FVII及FIX的目标，工艺流程简单，生产周期短，产品经三步病毒灭除措施，使用安全性高。
【IPC分类】C07K1/30, C07K1/34, C07K1/36, C07K1/18, C07K14/745
【公开号】CN105330736
【申请号】CN201510748336
【发明人】李春洲
【申请人】上海洲跃生物科技有限公司
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年11月6日