，收菌后超声破碎。该重组蛋白带有组氨酸标签，使用镍柱进行蛋白质的亲和 纯化。用不同浓度的咪唑溶液进行洗脱后，将各组分和流穿分别上样进行SDS-PAGE分离检 测，图1为融合有pelB信号肽和组氨酸标签的重组PMI蛋白的表达和纯化结果。重组PMI 蛋白的纯度在90%以上，浓度约为1-1. 5mg/mL，可以满足免疫动物和抗体筛选与鉴定的要 求。
[0033] 实施例2杂交瘤细胞系的建立
[0034] 一、免疫
[0035] 将实施例1中交联的多肽用弗氏完全佐剂（Sigma公司）乳化，免疫4-6周龄雌性 Balb/c小鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司），腹部皮下注射每只小鼠6点， 剂量为60yg/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂（Sigma公司）乳化， 剂量为30μg/只。第3次加强免疫后7天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗 免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为 50μg/ 只。
[0036] 二、细胞融合
[0037] 无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(ATCC)以5:1比 例混合，离心1500rpm，5min。弃上清后离心管放入37°C水浴中，在1分钟内缓慢加入lml的 PEG1500 (Roche公司），并搅动细胞。在温水中静置lmin后，加入10ml无血清的頂DM(Sigma 公司），混匀，离心l〇〇〇rpm，5min。弃上清后，加入10ml血清（PAA公司）小心的将细胞吹 打起来，并加入5ml混合10XHAT(Sigma公司）的胸腺细胞，混匀。再加入25ml含有2. 1 % 硝基纤维素（Sigma公司）的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。 将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37°C5%C02培养箱中培养。
[0038] 三、阳性杂交瘤筛选及保存
[0039] 融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团打入 事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37°C5 %C02培养箱中培养。
[0040] 四、ELISA筛选阳性杂交瘤细胞
[0041] 3天后，细胞量大约占底面积2/3,取100μ1上清用免疫原和合成多肽分别进行 ELISA筛选。阳性克隆完全换液，加入200μ1含饲养细胞和1 %HT(Sigma公司）的完全培 养基。两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基（含饲养细胞和HT) 的24孔板培养。五天后取100μ1上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板 和细胞培养瓶扩大培养并冻存。
[0042] 实施例3腹水诱生法制备单克隆抗体
[0043] -、腹水制备
[0044] 对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数~5X105,1ml。悬浮的细胞腹 腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4°C离心4000rpm， lOmin。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4°C或-20°C保存。
[0045] 二、单克隆抗体的纯化
[0046] 用HiTraprProteinAFF(GE公司）亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。 SDS-PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于-20°C。
[0047] 实施例4单克隆抗体亚类鉴定及亲和力测定
[0048] 一、亚类鉴定
[0049] 用100mMPBS(pH7. 4)稀释包被羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司）至 0. 5μg/ml，每孔加 100μ1，4°C，过夜。倾空液体，用含 0. 05%Tween的PBS(PBS-T)洗 3 次， 每孔加入200μ1封闭液（含2%BSA和3%蔗糖的PBS)，37°C孵育lh。倾空液体，用PBS-T 清洗3次。每孔加入0.lml杂交瘤上清，37°C孵育lh。倾空液体用PBS-T清洗3次。用封 闭液1 :1000稀释HRP标记的羊抗鼠（κ，λ)抗体或1 :2000稀释HRP标记的羊抗鼠（IgM， IgGl，IgG2a，IgG2b，IgG3,IgA)抗体（SouthernBiotech公司）0·lml每孔分别加入适当的 孔中，37°C孵育lh。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50μ1含0. 15%ABTS(Southern Biotech公司）和0. 03%H202的柠檬酸缓冲液（PH4. 0)进行显色反应，10-20min内测定 405nm波长下的0D值。结果显示，本发明单克隆抗体60728-35和60728-44均为IgGl型鼠 源单克隆抗体。
[0050] 二、亲和常数测定
[0051] 包被重组PMI蛋白，包被浓度为Syg/ml，100μ1/孔，4°C包被过夜，PBS-T洗3次。 每孔加200μ1封闭液37°C封闭2h，PBS-T洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，从1 : 200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37°C孵育lh，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗 鼠二抗1 :20000稀释，每孔100μ1，37°C孵育lh，PBS-T洗3次。每孔加入100μ1含0. 1% TMB(Sigma公司）和0· 03 %Η202的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50μ10. 5Μ硫酸溶 液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出0D值对应抗体稀释倍数的曲线，找 出彡1/2 "平台0D值"对应的稀释倍数A。利用下列公式计算出60728-35和60728-44分 泌的抗体亲和常数分别为1. 85X109和2. 46X109。
[0052]
[0053] 实施例5本发明单克隆抗体的应用效果
[0054] 从转基因和非转基因水稻叶片中提取蛋白，用免疫印迹的方法检测本发明的单克 隆抗体识别特异性及在检测转基因植物中的应用效果。免疫印迹实验过程如下：每种蛋白 上样5-10ng，进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶 蛋白带转移到PVDF膜上（Millipore公司）。将膜置于含5%脱脂奶粉的TBS-T封闭液中 4°C过夜。加入单克隆抗体60541S-4(1 :1000稀释）4°C孵育过夜。用TBS-T洗膜后，加入1 : 5000稀释的羊抗鼠二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），室温孵育1小时。再次TBST 洗膜，加入ECL超敏显色液（北京普利莱基因技术有限公司），以ChemiDocMP多色荧光成 像系统（Bio-Rad)进行化学发光图像数据的采集。
[0055] 实验结果如图2和图3所示，60728-35和60728-44均能识别特异性地识别转基因 水稻中的PMI蛋白。
[0056] 实施例6抗体的可变区序列测定
[0057] 培养新鲜的杂交瘤细胞，取上清进行抗原结合特性验证，证实完成后，离心收 集1〇6以上杂交瘤细胞。Trizol法提取杂交瘤细胞总RNA，取9yL总RNA，加入2. 5yL oligo(dT)12 - 18primer(10mM)，及 5μLdNTPs，混合均匀，70°C保温 5 分钟后置冰上 5分钟，或依照使用的逆转录酶进行变性操作。随后加入5yLRTΙχ^?·θΓ(5Χ)，2·5μL DTT(0. 1Μ)及1μL逆转录酶，42°C反应1小时。70°C孵育15分钟以终止反应，获得的cDNA 保存在-20°C。.将获得的第一链cDNA进行PCR扩增，在50yL反应体系中加入引物各 25pmol，引物的序列按照沈倍奋主编的《重组抗体》（科学出版社，2005年出版）一书中鼠 单抗引物序列设计和合成。其余dNTPs及缓冲液均按照常规加入，最后加入cDNA模板加 入1μL和1U热启动TaqDNA聚合酶。设置PCR扩增程序，通常为94°C40秒，52°C40秒， 72°C40秒，进行20至25各循环，最后72°C延伸3分钟，产物可置于4°C备用或直接电泳。 取20μLPCR产物进行电泳分析，在1.5 %琼脂糖凝胶上分离，轻链（κ轻链）的长度在 320 - 340之间，重链的长度在340 - 370之间，有该区域特异产物时切胶回收，克隆至Τ载 体或表达载体测序。
【主权项】
1. 一种结合PMI蛋白的免疫组合物，其特征在于包含由小鼠杂交瘤细胞系60728-35和 /或60728-44分泌的单克隆抗体。2. 权利要求1所述的单克隆抗体，其免疫小鼠用的抗原是具有SEQ ID No :1所示的氨 基酸序列，该抗原由大肠杆菌重组表达，经纯化后获得。3. 权利要求1所述的单克隆抗体，其重链和轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID No: 2和SEQ ID No :3所示或SEQ ID No :4和SEQ ID No :5所示的氨基酸序列。4. 权利要求1所述的单克隆抗体，其为小鼠IgGl亚型单克隆抗体。5. 权利要求1所述的单克隆抗体，其可单独或与其它缀合物连接完成含PMI生物样本 的免疫学检测和生物分离。6. 权利要求5所述的连接方式，包括经化学键偶联、静电吸附或者亲疏水性吸附。7. 权利要求5所述连接缀合物包括辣根过氧化物酶（HRP)、碱性磷酸酶(AP)、生物素 (Biotin)、异硫氰酸荧光素（FITC)、Cy3、Cy5、磁珠和琼脂糖。8. 权利要求5所述的免疫学检测方法包括利用抗体直接和抗原结合的酶联免疫吸附 检测（ELISA)、免疫印迹（Western Blot)、流式细胞术（FACS)、免疫组织化学（IHC)检测或 者免疫PCR检测方法。9. 权利要求5所述的生物分离方法包括利用抗体直接和抗原结合的琼脂糖免疫、免 疫磁珠吸附和流式细胞分选方法。10. 权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于可作为检测试剂用于转基因植物检测 试剂盒的制备。
【专利摘要】本发明公开了特异性识别转基因植物中非抗生素类安全筛选标记PMI(磷酸甘露糖异构酶)单克隆抗体及其制备方法，目的是为免疫学方法检测天然转基因物种(玉米、水稻、棉花等)中是否存在筛选标记PMI提供关键试剂材料。磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose？isomerase，PMI)基因是一种生物安全标记基因。制备该抗体的抗原为由大肠杆菌表达的可溶性全长PMI重组蛋白，最终获得的抗体属于IgG1亚型，编码其可变区的序列经基因克隆的方式获得。对天然转基因水稻材料的Western？Blotting检测发现，该抗体具有很好的特异性，可以用于对转基因材料的检测。
【IPC分类】C07K16/40, G01N33/577
【公开号】CN105330742
【申请号】CN201410387508
【发明人】刘国振, 尹长城, 荣瑞娟, 武鹏程, 兰金苹, 韦汉福, 魏健, 郝育杰, 刘丽娟, 吴 琳, 刘斯奇
【申请人】北京华大蛋白质研发中心有限公司
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2014年8月8日