[0091]Mm2:3，-AGTTGTAGTCN2GACTATTCGAT- 5r ；
[0092]Ni=A,T,C；N2=C,G,T
[0093] 其中黑体T表示芘修饰位点；&和N2分别表示错配碱基。磷酸位置芘修饰脱氧胸 苷亚磷酰胺单体及磷酸位置芘修饰的寡聚核苷酸见图2(a)和（b)。
[0094] 1、磷酸位置芘修饰寡聚核苷酸的热力学研究
[0095] 测量条件：寡聚核苷酸1μΜ溶解于10mMPBS缓冲液，氯化钠浓度为100mM。混合 溶液90°C退火，缓慢降至室温。在波长260nm下，使用BeckmanSeries800UV光谱仪记录 解链过程中的紫外吸收值；升温幅度1°C/min，读数间隔0. 5°C。溶解度曲线经过一阶导分 析后，由仪器给出溶解温度。
[0096] 2、磷酸位置芘修饰寡聚核苷酸的二级结构研究
[0097] 圆二色谱的测量条件：寡聚核苷酸浓度5μM，10mMPBS缓冲液，lOOmMNaCl。使用 JsscoJ-810spectropolarimeter光谱旋光仪在室温下测量，比色皿光程为0·lcm。
[0098] 波长扫描范围：220- 360nm;扫描速度：200nm/min;数据位扫描三次的平均结果。
[0099] 本发明通过监测解链过程中260nm波长下的紫外吸收，得到相应DNA杂交双链的 溶解曲线（表1)。从曲线图可以看到，磷酸位置芘修饰的核酸探针S0和完全配对序列S2 可以形成稳定的双链结构，解链过程中观察到典型的S型溶解曲线。相应的溶解温度在表 1中给出。芘修饰后双链溶解温度为66. 8°C，相较于天然的DNA双链S1+S2,溶解温度下降 1. 9°C，而错配序列有4°C到10°C的下降，这表明，在磷酸位置进行芘的修饰对双链形成后 的稳定性影响很小。
[0100] 同时，本发明使用圆二色谱对芘修饰DNA双链和天然DNA双链的二级结构进行了 比较（图3)。从实验数据可以直观看到，芘修饰的DNA双链S0+S2在波长250nm处出现波 谷，275nm处出现波峰，258nm处出现交界线，与天然DAN双链S1+S2的构型保持完全一致， 即在磷酸位置进行芘修饰后完全不改变双链的二级结构，仍然维持典型的B型DNA结构。
[0101] 表1探针S0和完全配对序列及错配序列形成双链的溶解温度和荧光性质
[0102]
[0103]3、磷酸位置芘修饰寡聚核苷酸的荧光性质考察
[0104] 荧光光谱的测量条件：寡聚核苷酸浓度1μM，10mMPBS缓冲液，100mMNaCl。使用 CaryEclipse焚光光度计在常温下测量。激发波长：345nm;激发狭缝：5nm;发射狭缝：5nm; 检测高压：600V;扫描速度：240nm/min。系统对谱线做平滑处理。
[0105] 从图4(a)可以看到，单链的探针S0荧光发射非常微弱，与缓冲溶液的荧光处于同 一背景水平；当和完全配对的序列S2进行简单混合后，荧光强度显著增强，最大荧光发射 位置位于波长378nm和398nm处。同时本发明记录在波长378nm处的荧光强度值（表1)， 可以发现，形成双链后，该波长下的荧光强度增强可达23. 5倍；相比于芘的核苷酸常规修 饰几倍到十几倍的荧光增强变化，该种修饰策略荧光增强的优势十分明显。
[0106]另外，考虑到常规修饰策略对于错配碱基的识别并不明显。本发明将探针与修饰 位点两侧含有单碱基错配的序列进行了混合，考察其荧光变化。从图4a、图5和表1可以看 出，单链探针S0不管与Mml(G-A,T，C)还是与Mm2(A-C，G，T)配对后，相较于完全配对 链S0+S2,荧光发射十分微弱，与单链探针S0的荧光强度处于同一水平。于是，磷酸位置芘 修饰的寡聚核苷酸荧光探针可以明显的区分出单碱基错配，有望在人类基因组单碱基多态 性分析上获得应用。
[0107] 4、磷酸位置芘修饰的核酸探针的动力学研究
[0108] 除了选择性和特异性，杂交动力学也是评价核酸探针性能是否优异的重要指标。 于是，本发明对磷酸位置芘修饰的核酸探针进行了动力学的研究。本发明在某一时间加入 和探针S0互补的DNA序列，记录荧光发射增强到平台区需要的时间（图4b)。从40s加入 靶序列开始，荧光强度快速增强，在不超过20s的时间内，荧光强度即达到平台，不再增加。 相比于一般的分子信标，荧光强度达到饱和需要若干分钟，而更复杂的分子信标，如三联颈 部的分子信标或哑铃状的分子信标，达到饱和则需要多达60分钟或更长。而磷酸位置芘修 饰的核酸探针和底物的反应时间远远低于一般探针，这给检测带来了很大便利。
[0109] 5、磷酸位置修饰的核酸探针对于RNA的识别
[0110] 为了研究芘在磷酸位置修饰的核酸探针对于RNA的识别，本发明将探针S0与完全 配对的RNA序列进行混合，记录其荧光发射情况（图6)。从荧光图谱上可以看到，当探针S0和RNA配对后，荧光增强同样十分显著，378nm处的荧光峰值增强可以达到36倍，甚至超 过与DNA的识别。这表明，磷酸位置芘修饰的核酸探针有望应用于生物样品中RNA的直接 测试。
[0111] 6、花修饰探针形成双链前后的焚光量子产率测量
[0112] 本发明对芘修饰探针形成双链前后的荧光量子产率进行了测量。依据以下公式：
[0113]Φ〇=Φs(Y〇/Ys) (As/Au) (n2u/n2s)
[0114] 其中，为标准样品0. 1M硫酸奎宁的荧光量子产率0.XX。YjPYs分别代表所测 样品和标准样品在相同激发波长345nm下的紫外吸收值；AJPAu分别表示所测样品和标准 样品的荧光发射图谱积分面积；nu和η3分别表示所测样品和标准样品溶液的折射率。本发 明配置345nm波长下吸收值相同且低于0. 05的各样品溶液和硫酸奎宁标准溶液进行测量。 经过计算，得到单链探针的荧光量子产率为0. 02,和完全互补DNA序列结合后，荧光量子产 率为0. 31。
[0115] 7、磷酸位置芘修饰寡聚核苷酸的计算机模拟
[0116] 本发明结合计算机模拟，对磷酸位置芘修饰核酸探针在和完全互补DNA配对前后 巨大的荧光差别进行了分析。当磷酸位置芘修饰的核酸探针S0以单链形式存在时，由于柔 性连接臂的存在，芘可以与邻近的碱基充分发生的相互堆积作用，使得芘自身的荧 光被邻近碱基通过光致荧光转移（PET)效应淬灭掉；当与完全互补的DNA序列配对后，芘被 挤出碱基堆积区域，完全暴露在水相的极性环境中，荧光不能被有效淬灭。同时，在形成双 链后，荧光发射谱图中398nm/378nm的较低比值，也暗示此时的芘处于较强的极性环境中。
[0117] 8、磷酸位置芘修饰探针S0对靶链的浓度效应的考察
[0118] 形成双链时，荧光强度的增强依赖于探针S0和靶链的特异性结合；于是，本发明 对磷酸位置芘修饰探针so对靶链的浓度效应进行了考察。本发明固定探针so的浓度为 1.ΟμΜ，从1.0μΜ逐渐降低靶链浓度，记录其荧光发射情况（图7)。从图上可以看出，随 着底物浓度的降低，荧光强度也逐渐降低；随后，本发明记录在波长378nm下的荧光强度， 对底物浓度进行线性拟合。结果显示为，F37Snm= 47. 98X[Concentration]-0· 06并且R2 = 0. 99，这表明底物浓度0. 1- 1. 0μΜ范围内线性关系良好。
[0119] 实验例2PCR过程的引物延长试验
[0120] 为进一步实现磷酸位置芘修饰核酸探针的实际应用，本发明将该探针应用于PCR 过程中的单碱基错配检测。为此，本发明分别使用两条只有一个碱基不同的模板即模板1 和模板2,将探针直接加入到PCR反应体系中，进行一个简易的PCR扩增反应。
[0121] PCR的引物延长试验是在AppliedBiosystemsVeriti热力学循环变温仪上进 行。反应液（10μΜ引物，0. 1μΜ单链模板DNA，1μΜ芘修饰探针S0, 250μMMg2+和1. 25u 的Taq酶，加入PCRbuffer，总体积50μL) 94 °C加热3min。之后设置不同的循环次数 0, 5, 10, 15, 20, 30, 40和80。每组引物延长试验同时进行6组重复试验。试验完毕，收集6 个反应管中所有的反应液合并进行荧光测量。
[0122] 探针S0:5' - TCA ACA TCA GTC TGA TAA GCT A - 3'；
[0123]引物：5，- GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG - 3'；
[0124] 模板 1:5'- TCA ACA TCA GTC TGA TAA GCT ACC CTA TAGTGA GTC GTA TTA GTG ATC - 3r；
[0125] 模板 2:5'-TCA ACA TCA GT￡ TGA TAA GCT ACC CTA TAGTGA GTC GTA TTA GTG ATC - 3r；
[0126] 探针SO中黑体T表示芘修饰位点（修饰策略同实施例3);模板链2中的错配碱 基位置用下划线标出。
[0127] 相对应模板1的PCR产物是和探针完全互补的，因此在不同的循环次数下，体系 的荧光发射强度随着循环次数的增加而增加（图8a);而对应模板2的产物是和探针有一 个碱基错配，随循环次数的增加，荧光强度的增加不明显，并且荧光强度本身处于较低水平 (图8b)。之后，本发明记录对应模板1和模板2,随着循环次数的增加，378nm处的荧光强度 的变化（图8a)。可以看到，对于PCR反应过程中的错配情况，探针可以有明显的识别；对于 完全正确的PCR反应过程，在荧光强度达到饱和前，荧光强度与循环次数有明显线性关系。 经过拟合为F37Snni= 1. 33X[Cycle]+2. 02且R2= 0. 99。以上表明，本发明提出的磷酸位置 芘修饰核酸探针可以应用于PCR反应过程的实时监测。
[0128] 实验例3磷酸位置芘修饰寡聚核苷酸探针的应用
[0129] 1、磷酸位置芘修饰核